1 203例不育患者的精子DFI與精液質量參數的相關性分析*

李清琴，董荔紅，吳丹梅，鐘福春，張 朵

(聯勤保障部隊第九〇〇醫院臨床遺傳與實驗醫學科，福建福州 350025)

據統計中國育齡夫婦中受不育不孕困擾的大約有10%～15%，其中男性因素約占50%[1]。精子核DNA完整性，是父源性遺傳信息能否準確傳遞給后代的關鍵。約20%的特發性不育癥存在精子DNA斷裂指數(DFI)高[2]。精子DFI高會降低卵母細胞的受精率、胚胎質量及受孕率[3]。精子功能評價除了精液質量分析外，增加精子DNA損傷檢測作為一項新指標，可預測自然受孕和體外受精的結局，監測環境污染物和醫療干預誘發的精子DNA損傷，評估男性生殖系統疾病及其相關治療[4-5]。為探究精子DNA損傷的發病機理，本文綜合分析男性不育患者年齡、濃度、活力與精子DFI之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015-2017年，在聯勤保障部隊第九〇〇醫院生殖中心治療不育癥患者的精液質量參數和精子DFI作為研究對象，年齡分布在20～62歲，平均(32.9±5.3)歲。有正常夫妻生活的育齡夫婦，未采取任何避孕措施，女方1年以上未懷孕，即可診斷為不育癥。排除具有以下情況的不育癥患者：重度吸煙、男性生殖器官發育缺陷、精索靜脈曲張、生殖器官炎性反應、全身性疾病、3個月內服用可能影響精液常規的藥物、無精子癥等。

1.2方法

1.2.1精液分析 禁欲2～7 d后采集精液標本，37 ℃恒溫箱液化15～30 min。充分混勻后，采用手工法進行精液質量分析。所有精液分析均由2名規范化培訓合格的技術人員操作完成，兩兩比對，進行嚴格的室內質控管理。根據《人類精液檢查與處理實驗室手冊第5版》標準，將精子運動分類為前向運動(PR)、非前向運動(NP)和不活動(IM)的精子。精液特性的部分參考值下限(95%CI)：精子濃度≥15×106/mL;精子總活力(PR+NP)≥40%，PR精子≥32%。根據精子活力(PR級精子比率)的強弱將弱精子癥分4類：輕度弱精子癥(20%≤PR<32%)、中度弱精子癥(10%≤PR<20%)、重度弱精子癥(1%≤PR<10%)、極度弱精子癥(PR<1%)。

1.2.2精子DFI檢測 流式細胞儀-精子染色質結構分析法進行精子DFI檢測。具體如下：精液經過低pH值的緩沖液處理后，精子核DNA鏈在斷裂處變性，吖啶橙熒光染色，通過BD FACS CnatoTMⅡ流式細胞儀收集熒光性號，Diva軟件進行數據分析。精子DFI值=有碎片化的精子數/被觀察的總精子數×100%，其中DFI值≤15%表示精子DNA完整性好；15%

1.2.3分組設計 觀察年齡對精子DFI的影響，將弱精子癥組(664例)和正常組(455例)根據年齡分為3組，年齡<30歲、年齡30～34歲、年齡>34歲。

1.3統計學處理 用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，選用非參數檢驗進行組間差異分析，P<0.05表示差異有統計學意義。采用多元線性回歸分析DFI與精液參數的相關性。

2 結 果

2.1精子DFI與其他參數之間的相關性 相關性分析結果顯示，精子DFI與年齡呈正相關(r=0.172，P<0.001)，與精子活力呈負相關(r=-0.457，P<0.001)，而與精子濃度無相關性。見表1。

表1 精子DFI與其他參數之間的相關性分析

2.2少、弱精子癥組和正常組的精子DFI比較 少、弱精子癥組的精子DFI分別為(27.2±15.0)%、(27.9±14.4)%，均明顯高于正常組的(16.8±8.5)%，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 少、弱精子癥組與正常組的精液質量參數及精子DFI比較

2.3不同程度的弱精子癥之間的精子DFI比較 將664例弱精子癥患者根據精子活力的強弱分為輕度、中度、重度及極度弱精子癥4組，各組的精子DFI均值分別為(20.1±9.6)%、(27.6±13.4)%、(32.8±17.3)%，(40.1±20.2)%，異常率(異常率=DFI值小于30%的檢測例數/總檢測例數×100%)分別為17.2%、33.0%、51.1%、63.9%，均明顯高于正常組的異常率8.1%，尤其是重度和極度弱精子癥組。不同精子活力組間的DFI值比較差異有統計學意義(P<0.001)。見表3。

表3 不同程度的弱精子癥之間的精子DFI比較

2.4年齡對精子DFI的影響 弱精子癥組中，各年齡組間的精子DFI比較差異有統計學意義(P<0.05)，隨著年齡增大，精子DFI明顯升高。而正常組中，各組間精子DFI比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同年齡組精子DFI比較

3 討 論

男性生育能力的評估指標主要包括精液質量分析、精漿生化、精子DFI等。雖然精液質量分析被認為是男性生育力的金標準，但是其不能檢測精子分子水平的異常。精子DNA損傷影響DNA堿基對的復制與轉錄，直接導致了遺傳信息的缺失并影響生物轉化功能，從而阻礙胚胎形成[6]。前期研究顯示，當精子DFI超過30%時，自然生育率會大幅降低。

精子DNA損傷的病理生理機制尚未完全清楚，已報道的影響精子DFI的因素主要包括：(1)精子發生和成熟功能障礙如組蛋白-魚精蛋白轉換故障導致染色質包裝異常；(2)男性生殖系統疾病或全身性疾病如炎性反應、糖尿病、精索靜脈曲張、惡性腫瘤等；(3)生活方式包括吸煙、喝酒、飲食等；(4)環境因素如接觸紫外線、電離輻射、有毒化學物質等；(5)其他因素，如年齡、禁欲時間、季節等[7-9]。

相關研究表明年齡增長，男性生育力下降、精液參數變差包括精子活動力降低、精子DNA損傷升高和精子形態異常率升高[10-11]。這可能因為年齡增加，活性氧(ROS)積累，高水平的ROS促進氧化應激，誘導脂質過氧化和進一步產生ROS，導致細胞凋亡或對DNA的氧化損傷[12]。與國內外報道一致，本研究也發現年齡與精子DFI呈正相關。本研究還發現弱精子癥組中，年齡>34歲的精子DFI顯著高于年輕≤34歲男性，>34歲組的異常率為40.9%，30～34歲組的異常率為32.5%、<30歲組的異常率為23.4%。而正常組中，年齡差異無統計學意義。

另一方面，男性不育中弱精子癥大約占19%，其特征是精子活力降低或無活力。精子運動的影響因素包括遺傳性疾病(內臟逆位-鼻竇炎-支氣管擴張綜合征、囊性纖維化)，代謝和結構綜合征(線粒體和鞭毛缺乏)，細胞凋亡等[13]。本研究發現與正常組相比，精子DFI在弱精子癥患者中明顯升高，異常率高于正常組，尤其是重度和極度弱精子癥組，其升高水平與精子活力下降的程度有明顯的相關性。這可能是由于精子膜內含有較高濃度的不飽和脂肪酸，過量ROS會誘導其發生脂質過氧化，使精子膜的流動性和完整性受到損傷，導致精子線粒體、精子核內DNA受損。高水平的ROS釋放到細胞質中，減少了精子活力的能量供應，使精子活力降低，細胞凋亡，進而導致男性不育。MAHFOUZ等[14]發現精液中ROS水平增加25%，精子DFI大約會增加10%，精子活力大幅度下降。SHI[15]等研究也發現ROS水平增加，可能誘導精子氧化損傷，精子功能受損，精子活力可能是這種損傷最早和最敏感的指標之一。因此，筆者認為某些因素如過量ROS水平等會同時影響精子DNA損傷與精子活力。

綜上所述，精子DFI與精子活力呈負相關，且升高水平與精子活力的下降程度有關，提示精子DNA損傷可能存在與精子活力下降相同的影響機制。本研究還發現在弱精子癥患者中，精子DFI與年齡呈正相關，>34歲組中精子DFI顯著高于≤34歲組，提示年齡也是阻礙弱精子癥患者獲取孩子的不利因素之一。因此，男性不育患者應正視并及早就醫。