鐵蛋白籠形納米顆粒應用于HIV-1 P24抗原高靈敏檢測的研究*

張利沙，曾德軍

(1.德陽市第二人民醫院檢驗科，四川德陽 618000；2.德陽市疾病預防控制中心微生物檢驗所，四川德陽 618000)

醫學檢驗技術在疾病的預防和診斷中發揮重要作用，特別是低豐度指標的檢測具有重要價值。生物自組裝納米材料引入生物傳感系統并應用于醫學檢驗，能夠實現低豐度、高靈敏度的檢測[1-4]。鐵蛋白作為一種生物自組裝納米材料，操控性好，應用于生物傳感系統具有實際意義。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 PCR儀、蛋白電泳裝置購自美國Bio-Rad公司；離心機購自德國Thermo Electron公司；冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；核酸電泳儀購自中國北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統購自美國Alpha公司；超聲細胞粉碎儀購自美國Sonics公司；微孔板檢測儀購自美國Bio-Tek公司；超微量樣本分光光度計購自美國Thermo公司；透視電子顯微鏡購自日本日立公司，型號H7000。

DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、dNTPs等均購自日本Takara公司；PCR產物回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、核酸膠回收試劑盒等均購自美國Omega Bio-Tek公司；所用抗體均購自中國上海優寧維生物科技股份有限公司；蛋白質Marker(Fermentas)、DNA Marker(TransGen Biotech)、BCA Protein Assay Kit(Pierce)、HIV-1 P24抗原酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒等均購自中國上海起發實驗試劑有限公司。

1.2引物與測序 DNA測序由中國華大基因測序公司完成，引物合成由中國上海生工生物工程股份有限公司完成，見表1。

表1 引物序列

1.3菌種及質粒 菌種：大腸桿菌DH5α作為目標質粒復制菌種；大腸桿菌BL21(DE3)作為目標質粒表達菌種；大腸桿菌BL21基因組DNA作為擴增生物素連接酶基因序列(BirA)的模板。質粒：pET28a-F-H-Chain作為擴增鐵蛋白基因序列(rHF)的模板；pET28a作為承載耦聯生物素結合肽(BAP)的鐵蛋白基因序列原核表達質粒載體；pCDFDuet作為承載BirA的原核表達質粒載體。所用菌種和質粒均來源于本實驗室保存。

1.4方法

1.4.1質粒構建 以pET28a-F-H-Chain為模板，分別以FF1、FF2、FF3為正向引物，以FR為反向引物，經3次PCR擴增出耦聯生物素結合肽的鐵蛋白基因序列BAP-linker-rHF，NcoⅠ/XhoⅠ酶切并插入pET28a，構成pET28a-rHF-BAP；以大腸桿菌BL21(DE3)基因組為模板，BF、BR為正反向引物，PCR擴增BirA，NcoⅠ/SalⅠ酶切并插入pCDFDuet，構成pCDFDuet-BirA。

1.4.2生物素化鐵蛋白的表達 pET28a-rHF-BAP、pCDFDuet-BirA共轉化大腸桿菌BL21(DE3)獲得目標工程菌，以終濃度1 mmol/L的異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，25 ℃，190 r/min，誘導培養10 h；以未經誘導的工程菌為對照，全菌裂解液通過聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察目標蛋白表達情況。

1.4.3生物素化鐵蛋白的純化和表征 誘導表達的工程菌經超聲破碎，并以40%蔗糖為基質，270 000 r/min超速離心4 h，上清透析去糖，獲得純化的生物素化鐵蛋白。分別針對鐵蛋白和生物素進行免疫印跡試驗(Western blot)驗證分析；同時以2%，pH7的磷鎢酸負染，透視電子顯微鏡觀察自組裝結果，并用Image J圖像軟件分析處理。采用BCA法蛋白濃度測定試劑盒測定提取純化的生物素化鐵蛋白濃度。

1.4.4生物素化鐵蛋白應用于P24檢測 以5 μg/mL HIV-1 P24抗體包被酶標板，并以0.5%脫脂奶粉封閉；按照ELISA操作步驟，分別依次加入10倍梯度稀釋的HIV-1 P24抗原(1 000～0.001 ng/mL)，每個濃度設3個重復，生物素化HIV-1 P24抗體，鏈霉親和素，生物素化鐵蛋白(24 μg/mL)，鏈霉親和素耦聯的辣根過氧化物酶；最后以現配TMB顯色，2 mol/L硫酸銨終止反應，450 nm讀取吸光度；以蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作線性回歸曲線，并與商業HIV-1 P24抗原ELISA試劑盒作對比。

2 結 果

2.1質粒構建 通過基因重組手段將597 bp的rHF-BAP基因片段插入到質粒載體pET28a上，構建出pET28a-rHF-BAP。將966 bp的BirA基因片段插入到質粒載體pCDFDuet上，構建出pCDFDuet-BirA原核生物表達載體。2個表達載體均經限制性酶切和基因測序驗證無誤。

2.2生物素化鐵蛋白的表達 pET28a-rHF-BAP、pCDFDuet-BirA共轉化大腸桿菌BL21(DE3)獲得目標工程菌。在IPTG的誘導作用下，全菌裂解液經SDS-PAGE顯示：在相對分子質量25.0×103和35.0×103大小左右出現2條明顯蛋白條帶，相對分子質量與耦聯生物素結合肽的鐵蛋白(23.5×103)和生物素連接酶(32.0×103)蛋白相對分子質量大小一致。見圖1。

2.3生物素化鐵蛋白的表征 對提取純化的生物素化鐵蛋白進行Western blot驗證分析顯示：針對鐵蛋白和生物素的蛋白印跡均在25.0×103左右處出現目標印跡條帶，與耦聯生物素結合肽的鐵蛋白(23.5×103)相對分子質量大小一致。透射電鏡觀察純化的生物素化鐵蛋白在體外自組裝的情況，發現提取純化的生物素化鐵蛋白懸液存在大量直徑為12 nm左右的顆粒狀規則結構，與鐵蛋白籠形納米結構一致。通過BCA法測定得出提取并純化的生物素化鐵蛋白原濃度為1.8 mg/mL。見圖2、3。

注：L1泳道為誘導后的工程菌裂解液電泳；L2泳道為未經誘導工程菌裂解液電泳
圖1生物素化鐵蛋白誘導表達電泳結果

注：A表示針對鐵蛋白的免疫印跡試驗；B表示針對生物素的免疫印跡試驗
圖2免疫印跡試驗驗證生物素化鐵蛋白

圖3 生物素化鐵蛋白自組裝電鏡表征

2.4生物素化鐵蛋白應用于P24檢測 將提取純化所得的生物素化鐵蛋白應用于HIV-1 P24 抗原ELISA檢測中，與商業化HIV-1 P24 抗原ELISA檢測試劑盒相比較：按照cut-off=2.1×陰性對照，商業化HIV-1 P24 抗原ELISA檢測試劑盒對HIV-1 P24抗原的檢測下限為1 ng/mL，展示有生物素的鐵蛋白籠形納米顆粒作橋聯的ELISA檢測對HIV-1 P24抗原下限達到0.1 ng/mL，檢測下限提高10倍。見圖4。

圖4 生物素化鐵蛋白籠形納米顆粒應用于P24 ELISA檢測

3 討 論

檢測技術的更新與發展，特別是對低豐度指標的高靈敏檢測的開發能夠給臨床醫療提供依據和指導，例如HIV-1 P24抗原的高靈敏檢測能夠提高艾滋病早前期的檢出率，縮短檢測窗口期，為臨床診治提供指導[5-7]；同時低豐度、高靈敏度的檢測也深化和補充了目前醫學檢驗技術中的不足。基于納米材料的各種特性，將納米材料引入到檢驗技術中得到了很好的效果[8-9]，特別是容易通過基因工程改造的生物源性納米結構，例如病毒顆粒，大部分病毒由單體衣殼蛋白組裝形成的規則結構，通過單體分子修飾可在病毒顆粒上展示多分子的功能基團，且這些新改造的病毒顆粒處于納米水平，應用于生物傳感能實現信號放大[10-12]。

鐵蛋白具有病毒衣殼蛋白的性質，在體外能自組裝形成兩種納米結構，即大鐵蛋白籠形納米顆粒由24個基本元件形成八面體對稱的中空結構，外徑12 nm，小鐵蛋白籠形納米顆粒由12個基本元件形成四面體對稱的中空結構[13]。以大鐵蛋白籠形納米顆粒為對象，通過分子生物學的手段對鐵蛋白單體進行生物素化修飾，鐵蛋白單體自組裝時可將生物素展示于籠形納米顆粒上，1個納米顆粒可展示24分子生物素，通過生物素與鏈霉親和素的特異性結合，檢測信號被放大，提高了檢測相對靈敏度。經過驗證，將生物素化鐵蛋白應用到HIV-1 P24抗原ELISA的檢測當中，與商業化HIV-1 P24抗原ELISA試劑盒檢測比較，檢測下限有明顯提高，可以用于檢測低豐度的分析指標。

鐵蛋白籠形納米顆粒上功能性分子展示不僅僅局限于生物素，也可以將檢測相關聯的某種或多種分子展示于鐵蛋白籠形納米顆粒上，構建出單功能或多功能的鐵蛋白籠形納米顆粒[14-15]，實現其特定的檢測指標的高靈敏甚至超靈敏檢測。

4 結 論

通過基因工程技術，采用分子生物學的手段，成功構建生物素化鐵蛋白單體，并在體外自組裝形成表面展示有多分子生物素的鐵蛋白籠形納米顆粒。以HIV-1 P24抗原檢測為例，將其應用到ELISA檢測中，與商業化的HIV-1 P24抗原ELISA試劑盒檢測相比，成功實現了檢測信號的放大，具有相對較高的檢測靈敏度，可用于檢測相對豐度較低的分析指標。