沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃微生物區系和瘤胃液消化酶活性的影響

■趙亞星 敖長金 包志碧 范澤軍 杜紅喜

（內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特010018）

反芻動物主要通過瘤胃微生物和自身分泌的酶對飼料進行消化。瘤胃微生物可消化飼料中50%的粗纖維和70%～85%的可消化干物質，產生揮發性脂肪酸、CO2、乳酸及甲烷，并產生微生物蛋白和B 族維生素供反芻動物機體利用[1]。因此，通過促進或抑制某些瘤胃微生物，可使得消化代謝的損失降到最低，提高其飼料利用率和生產性能。植物提取物作為瘤胃調控劑具有天然無危害的特點，因此成為當下研究的熱點。李大彪等[2]研究指出在山羊和綿羊飼糧中添加單寧能夠降低瘤胃總細菌和總厭氧真菌的含量，且山羊瘤胃內總細菌和總厭氧真菌含量下降程度顯著高于綿羊。王夢竹等[3]研究發現不同劑量的苜蓿黃酮對纖維素酶活性影響不同,當添加4%時,木聚糖酶、纖維二糖酶等纖維素酶活性最高。苑文珠[4]的研究結果表明在飼糧中添加茶皂素可顯著降低原蟲，并改善湖羊的生產性能。

沙蔥，又名蒙古韭，屬被子植物門，百合科，蔥屬。是一種含有較高粗蛋白和代謝能，較低中性洗滌纖維的優質牧草，為牛羊等反芻動物喜食，主要分布在內蒙古中西部地區[5]。沙蔥的葉和花具有藥理作用，既能開胃、消食、降血壓，又能提高免疫力，抗菌抗病毒[6]。沙蔥能夠改善羊肉風味[7]，改善肉品質[8]，提高動物抗氧化能力及免疫力[9]。

目前沙蔥作為植物添加劑的研究熱點之一，其研究主要集中于沙蔥及其提取物對肉羊生產性能和肉品質的影響等方面，關于沙蔥水溶性提取物和脂溶性提取物對瘤胃微生物以及瘤胃消化酶活性研究較少。因此，本試驗通過在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物，研究其對肉羊瘤胃微生物和消化酶活性的影響，以期在瘤胃微生物層面上揭示沙蔥及其提取物改變羊肉品質的作用機理，并為沙蔥及其提取物在肉羊實際生產中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧

1.1.1 試驗動物

選取24只，體況良好，體重（37.1±0.5）kg相近的杜寒雜交F1 代（小尾寒羊×杜泊羊）進行試驗。試驗期內每天6：00和18：00飼喂2次，自由飲水?；A飼糧組成和營養成分見表1。

1.1.2 沙蔥提取物的制備

沙蔥提取物的制備：將沙蔥粉脫脂后與75%的乙醇按照料液比為1:30 混合，超聲微波處理20 min，得到黃色粉末的脂溶性提取物。脂溶性提取物的得率為2.8 g/10 g 沙蔥粉。將沙蔥粉脫脂后與蒸餾水按照料液比為1:20 混合，放于65 ℃烘箱，得到紅褐色粉末的水溶性提取物。水溶性提取物的得率為3.4 g/10 g沙蔥粉。

本次試驗開始前已知沙蔥水溶性提取物中主要活性物質為有機酸及其衍生物（α-羥基異丁酸、2-羥基丁酸）、植物激素（N6-異戊烯腺嘌呤）、羥基肉桂酰衍生物（對羥基苯丙酸）。沙蔥脂溶性提取物中主要是氨基酸衍生物[S-（5-腺苷）-L-高半胱氨酸]，脂質-甘油磷脂（溶血磷脂酰膽堿)、脂質-甘油脂(單酰甘油脂)[10]。

1.1.3 基礎飼糧

1.2 試驗設計

本試驗采用單因素隨機分組設計，每組羊按照同質性原則隨機分為4組，每組6只羊。試驗期共75 d，其中預試期15 d，正式試驗期60 d。對照組（CON Group）飼喂基礎飼糧，沙蔥組（AMR Group）在基礎飼糧中添加10 g/(d·只)沙蔥粉，水溶組（AWE Group）在基礎飼糧中添加3.4 g/(d·只)沙蔥水溶性提取物，脂溶組（AFE Group）在基礎飼糧中添加2.8 g/(d·只)沙蔥脂溶性提取物。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（干物質基礎）

1.3 測定指標

1.3.1 瘤胃液的采集與測定

在正飼期內，每隔30 d各組隨機選取4只羊在晨飼后2 h 采集瘤胃液。裝保溫瓶后帶回實驗室，經四層無菌無酶紗布過濾后，放入液氮罐種待測。

1.3.2 瘤胃微生物的定量

1.3.2.1 總DNA的提取

采用珠磨硯法提取瘤胃微生物總DNA，本方法須注意的是玻璃珠的用量和細胞的破碎程度以及蛋白質的去除[11]。

1.3.2.2 瘤胃微生物引物的設計與合成

1.3.2.3 目的片段的擴增

25 μl 的反應體系：模板2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA連接酶12.5 μl，dd水8.5 μl。

反應參數：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min,36個循環。擴增產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Axygen Biosciences）將目的片段進行回收。

1.3.2.4 PCR產物的克隆

根據pGM-T 克隆試劑盒說明，將PCR 產物與pGM-T載體進行連接。

10 μl 的反應體系：目的PCR 片段7 μl，T4DNA ligase 1 μl，10×T4DNA Ligation Buffer 1 μl，pGM-T Vector 1 μl。使用Top10感受態細胞。

1.3.2.5 陽性質粒的篩選與鑒定

將過夜的菌液做PCR 檢驗，配置25 μl 的體系：模板（菌液）2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，Mix 12.5 μl。

表2 瘤胃微生物的引物序列及參數

PCR反應的產物經過電泳后，所得的條帶與目的條帶大小一致，故為陽性克隆菌液，委托華大基因科技服務有限公司進行測序。驗證正確的菌液后，根據質粒小提試劑盒的說明書提取質粒。

1.3.2.6 標準曲線的制作

提取質粒后用酶標儀測定質粒的濃度，根據公式計算出陽性質粒的拷貝數（計算公式：質?？截悢担▊€/μl）=[6.02×1023（個/mol）×DNA 濃度（ng/μl）]/{DNA長度（bp）×660[g/(mol·bp)]}[13]。

將已知拷貝數的質粒以10倍濃度梯度連續稀釋5 個梯度，每梯度設3 個重復，無酶水作對照，進行實時熒光定量PCR，最終得到與質?？截悢岛脱h閾值（Ct）對應的線性關系的標準曲線。

1.3.2.7 瘤胃微生物實時定量PCR檢測

參照熒光染料SYBR PreMix Plus 說明書建立25 μl的體系，將樣品統一稀釋到10 ng/μl。將實時熒光定量PCR得到的Ct值代入標準曲線，得到總細菌，總厭氧真菌和原蟲的數量。計算公式如下：

總細菌、總厭氧真菌和原蟲數量（個/g）=（MQ×C×VD）/（S×V）[14]

式中：MQ——根據標準曲線Ct計算得到的總細菌，總厭氧真菌和原蟲數量（個）；

C——每個樣品基因組DNA濃度（ng/μl）；

VD——提取DNA 時最后溶解DNA 的ddH2O 的體積（μl）；

S——用于實時定量PCR的DNA的量（ng）；

V——提取粗DNA時瘤胃內容物樣品用量（g）。

總細菌，總厭氧真菌和原蟲數量最終用拷貝數的常用對數[1g（個/ml）]表示。

1.3.3 纖維素酶活性的測定

按照Agarwal 等[15]的方法對瘤胃液濾紙酶、羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶、淀粉酶和蛋白酶的活力進行測定。濾紙酶活力指1 g酶水解反應中每分鐘生成1 μmol 葡萄糖的酶量。羧甲基纖維素酶活力指一定條件下每分鐘從1 g 羧甲基纖維素鈉中降解1 μmol 還原糖所需的酶量。木聚糖酶活力指一定條件下每分鐘催化分解1g 木聚糖產生1 μmol 木糖所需的酶量。纖維二糖酶活力定義為1 g酶水解反應中每分鐘生成1μmol還原糖所需的酶量。淀粉酶活力指每分鐘水解1ml淀粉生成1μmol還原糖所需的酶量。蛋白酶活力指1 ml 液體酶一定條件下每分鐘水解酪素產生1 μg酪氨酸所需的酶量。

1.4 數據統計分析

利用Excel 整理數據，SPSS 17.0 軟件的one-way ANOVE 對數據進行單因素方差分析，用Duncan's 法對平均值進行多重比較。P＜0.05 為差異顯著判定標準，P＞0.05為差異不顯著判定標準。

2 結果

2.1 瘤胃微生物標準質粒PCR檢測

對目標片段進行膠回收進行克隆，將挑取得單克隆菌液落于液體培養基中過夜。提取質粒，PCR檢測是否為目的片段，然后送檢測。

2.2 陽性克隆驗證

測序結果表明陽性克隆片段與總細菌的同源性為98%。與厭氧真菌的同源性為99%，與原蟲的同源性為97%，且含有完整的引物序列，這說明構建了含有目的片段的質粒，能夠制作標準品。

2.3 標準曲線

總細菌數量（y1）、總厭氧真菌數量（y2）、原蟲數量（y3）、牛鏈球菌（y4）、棲普雷沃氏菌（y5）根據Ct(x)的標準曲線公式如下：

y1=-3.10Lg(x)+43.10；R2=0.998；y2=-3.23Lg(x)+43.45，R2=0.960；y3=-3.34Lg(x)+43.36；R2=0.989；y4=-3.792Lg(x)+66.79，R2=0.924；y5=-3.816Lg(x)+57.63，R2=0.937。

2.4 沙蔥及其提取物對瘤胃微生物區系的影響

由表3可知，與對照組相比，在30 d和60 d時，試驗組的細菌含量顯著提高（P＜0.05）。在60 d時，水溶組的總厭氧真菌含量顯著高于（P＜0.05）其他組。在60 d時，沙蔥組的原蟲含量顯著（P＜0.05）降低。各處理組的牛鏈球菌和棲普雷沃氏菌含量沒有顯著變化（P＞0.05）。

2.5 沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃液消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，在30 d和60 d時，沙蔥及其提取物組木聚糖酶活性和脂肪酶活性顯著（P＜0.05）提高，在60 d時，沙蔥及其提取物組濾紙纖維素酶活性顯著（P＜0.05）提高。在60 d 時，沙蔥水溶組β-葡萄糖苷酶活性顯著（P＜0.05）提高。在30 d時，沙蔥及其提取物組淀粉酶活性顯著提高。60 d時，脂提組、水提組淀粉酶活性顯著（P＜0.05）提高。

3 討論

3.1 沙蔥及其提取物對瘤胃微生物區系的影響

在反芻動物的瘤胃中棲息著數目龐大、種類復雜的各種微生物，主要包括細菌、原蟲和厭氧真菌。反芻動物主要依賴瘤胃內的微生物能夠有效的消化和利用飼料中的各種營養物質。細菌是瘤胃內數量最多，功能最復雜的一類微生物，也是瘤胃內最主要的消化營養物質的微生物[16]。瘤胃內的白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌是主要的纖維分解菌，可產生大量的纖維素酶和半纖維素酶，在纖維降解過程中發揮重要的作用[17]。本試驗研究發現在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物后顯著提高了肉羊瘤胃內總細菌含量，可能原因是添加沙蔥及其提取物抑制了原蟲的數量從而影響其對細菌的吞噬能力，因此，瘤胃內細菌大量增殖，利于改善纖維物質在瘤胃內的發酵和降解而提高其消化利用率。

表3 沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃微生物區系的影響[lg(個/ml)]

表4 沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃液消化酶活性的影響

瘤胃中各類微生物之間的協同作用下反芻動物得以分解利用飼料中的纖維物質，其中細菌和真菌在降解纖維物質過程中發揮了80%的作用[18]。反芻動物瘤胃內厭氧真菌的數量及種類均少于細菌，但其可對粗飼料的纖維組織結構進行破壞，打開細菌進入纖維的通道，因此在瘤胃內纖維消化過程中占據主導地位[19]。據Joblin 報道，瘤胃液真菌產生的纖維素酶的活性高于瘤胃纖維素分解菌產生的酶[20]。厭氧真菌可釋放降解纖維的關鍵酶，并產生酯酶及木質素酶，因此對維護瘤胃功能方面起著重要作用[21]。張霞[22]研究發現在綿羊飼糧中添加沙蔥水溶性提取物后顯著提高了真菌的數量，與本試驗結果一致，可能原因是沙蔥水溶性提取物提高了真菌生長所需要的氮源銨根離子和氨基酸濃度，從而使真菌數量增加。

原蟲是瘤胃內微生物的重要組成部分，主要通過物理作用破壞纖維結構，同時可分泌纖維素降解酶[23]。Coleman等[24]研究表明內毛蟲等個體較大的原蟲能夠吞噬和消化纖維素，并利用纖維素的降解產物合成其細胞內的多糖。瘤胃微生物種類和數量主要受動物品種、日糧結構、環境、日糧添加物等因素的影響。趙春艷[25]研究指出，在綿羊飼糧中添加沙蔥能夠有效抑制原蟲數量，從而使細菌合成MCP 的量增加。趙國芬[26]通過在綿羊飼糧中添加4%沙蔥發現纖毛蟲的數量顯著減少。本試驗研究發現在肉羊飼糧中添加沙蔥可顯著降低瘤胃原蟲數量，與上述研究結果一致，可能原因是添加沙蔥破壞了原蟲的生活環境或者直接作用于原蟲，從而導致原蟲數量降低。

3.2 沙蔥及其提取物對瘤胃內纖維素酶活性的影響

反芻動物瘤胃內纖維類物質主要依靠瘤胃內微生物分泌的各種酶進行分解和消化，進而被宿主動物所利用，因此反芻動物瘤胃微生物對飼料的利用效率較大程度上取決于瘤胃微生物酶的活性。瘤胃微生物產生的纖維素酶包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，在這3 種酶的協同作用下才能降解纖維的結晶結構，上述酶的活性可以更準確的反映出瘤胃內微生物對纖維物質的利用和合成MCP的能力[27]。

羧甲基纖維素酶是一種內切葡聚糖酶，可將纖維素分解為葡萄糖和纖維二糖，所有纖維素分解菌均能產生此酶。張霞[22]研究發現，在綿羊飼糧中添加沙蔥和沙蔥提取物顯著提高了羧甲基纖維素酶的活性，本試驗也得出類似的結果，在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物能顯著提高肉羊瘤胃內羧甲基纖維素酶活性，這表明添加沙蔥及其提取物可加快飼料纖維物質的降解速度，提高纖維的初始消化率。木聚糖酶主要由瘤胃內黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌產生，是一組能夠水解木聚糖的多酶復合體，包括內切β-1，4木聚糖酶、外切β-1，4木聚糖酶和β-木糖苷酶。β-葡萄糖苷酶又稱為二糖水解酶，可水解纖維二糖，芳基-β-葡萄糖苷酸而產生葡萄糖等終產物。濾紙纖維素酶活性是內外切葡聚糖酶和葡萄糖甘酶協同作用的結果，是瘤胃總纖維素酶活的衡量指標。微晶纖維素酶是表明纖維酶解效率的重要指標，其活性可反映瘤胃內多種酶活性。果膠酶可將植物中果膠分解為β-半乳糖醛酸，其本質是聚半乳糖醛酸水解酶。本試驗研究結果顯示，在肉羊日糧中添加沙蔥及其提取物能顯著提高木聚糖酶活性，這與前人研究結果一致[22],可能原因是飼糧中添加沙蔥及其提取物提高了瘤胃內TVFA的濃度，TVFA釋放的能量充足，微生物分解飼糧產生的NH3-N 與能量的供應水平最適宜微生物的生長繁殖，MCP 濃度的增加又進一步改善瘤胃發酵，所以纖維分解菌分泌的酶活性提高。

3.3 沙蔥及其提取物對瘤胃內淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影響

提高消化酶活性可加快營養物質的降解速率，為反芻動物提供更多的可吸收和利用的營養物質，進而提高反芻動物的營養物質消化率、飼料利用率和生產性能。瘤胃微生物分泌的淀粉酶可將瘤胃內大部分淀粉水解為麥芽糖，降解所得的麥芽糖轉化為VFA為機體提供能量[28]，其活性的高低直接決定著飼料中可溶性碳水化合物的分解程度[29]。瘤胃內牛鏈球菌、丁酸梭菌及嗜淀粉瘤胃桿菌是主要的淀粉分解菌，能夠分泌較強活性的淀粉酶[30]。有研究表明瘤胃內大部分內毛蟲和瘤胃厭氧真菌也具有分解淀粉的能力[31]。本試驗研究發現，添加沙蔥及其提取物可顯著提高肉羊瘤胃內淀粉酶活性，可能是由于沙蔥及其提取物通過促進瘤胃纖維分解菌的生長[10]，提高了粗飼料的消化率，進而使各種碳水化合物顯著增加，提高了淀粉酶的活性。

瘤胃液中含有少量的脂肪酶，能夠參與飼料中脂類物質的消化和代謝，外源脂肪需經過脂肪酶的消化分解后才能透過細胞膜，體內脂肪的儲存、動用和細胞內的脂類代謝都需要脂肪酶的參與。脂肪酶先將脂肪水解為甘油和脂肪酸，水解產物再進入小腸黏膜細胞被進一步消化利用[32]。本試驗研究發現在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物顯著提高了瘤胃液脂肪酶活性，這與趙春艷[25]和趙國芬[26]的研究結果一致。

瘤胃內降解蛋白質的微生物較多，但真菌和原蟲對蛋白質的降解能力較弱，溶纖維丁酸弧菌、棲普雷沃氏菌和嗜淀粉擬桿菌的數量多且活性強，對瘤胃內蛋白質降解具有重要作用[33]。姜衛紅[34]通過一系列的研究指出蛋白酶在瘤胃內pH 值為7.0 時活性最高。本試驗研究發現在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物，瘤胃內蛋白酶活性沒有顯著變化，原因可能是蛋白酶的活性較穩定，不易變化[30，33，35]。

4 結論

①飼糧中添加沙蔥及其提取物能夠促進肉羊瘤胃總細菌和總厭氧真菌的生長，同時降低瘤胃原蟲的數量。

②飼糧中添加沙蔥及其提取物能夠促進瘤胃內纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶的分泌和活性的提高。

③沙蔥及其提取物能夠影響瘤胃微生物區系，且提高瘤胃液相關消化酶的活性。