富馬酸及魚油對瘤胃微生物體外培養中亞油酸代謝生成甲烷及CLA的影響

■閆 研 張軍芳 孫 斌 王 英 崔 巖 孫建富 李香子

(延邊大學農學院肉?？茖W與產業技術協同創新中心，吉林省延吉市133000)

隨著人類生活水平的不斷提高，飲食與健康問題受到了廣泛的關注。而動物脂肪酸與健康密切相關，人類如果攝食過多飽和脂肪酸容易引發各類疾病，而共軛亞油酸（CLA）是國際上公認的唯一動物源性功能性脂肪酸，是反芻動物脂肪中含有的一種具有特異性生物活性作用的微量不飽和脂肪酸，具有重要的生物學功能。Pariza等人發現牛肉含有一種由一系列共軛亞油酸異構體組成的抗致癌因子[1]。“共軛亞油酸（CLA）是唯一明確顯示能抑制實驗動物的致癌作用的脂肪酸”(NRC, 1996)。最近，發現了另一種有益人體健康的共軛異構體順9，反11，順15 亞麻酸，據報道，化學制備的天然CLnA 的異構體溶解腫瘤細胞的作用優于CLA，抑制各種人類腫瘤細胞的生長[2-5]，并且已研究表明可以顯著減低總膽固醇，載脂蛋白B-100和肝臟甘油三酯[6-7]。

在全球變暖的危害中，甲烷潛在威力卻遠遠超過了二氧化碳。甲烷是在反芻動物瘤胃微生物分解、發酵植物纖維過程中產生的。而丙酸是一種生成甲烷的重要物質，并且在瘤胃中由丙酸前體物合成。故調控瘤胃發酵以減低甲烷的產生和增加CLA或CLnA的產量將有利于畜牧業發展、環境和人類的健康。理論上來講，通過選擇性的電子代謝途徑降低電子能夠降低甲烷生成[8]。在瘤胃中使用丙酸鹽生成前體轉變瘤胃發酵的丙酸鹽生成途徑將是理想的方法[9], 因為它的前體利用代謝氫生成丙酸，并且在瘤胃發酵過程中改變代謝氫利用效率而引起其他中間代謝產物和終產物的分配[10]。而富馬酸已被確認可以改變氫傳遞的路徑，通過減少甲烷排放量增加丙酸的含量[11-12]。也有報道魚油也能增加瘤胃丙酸（C3）的含量[13-14]，并被作為一種有效的瘤胃甲烷抑制劑[15]。對植物油，丙酸前體物（fumarate, FA）及魚油對共軛亞油酸和甲烷生產在瘤胃微生物發酵中的關聯效應的研究，至今尚未見報道。

因此，本試驗旨在研究富馬酸及PMUF（C20:5，C22:6）在瘤胃微生物的作用下對亞油酸的代謝機制及其調控脂肪酸代謝過程中對甲烷合成效率的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液采集

3 頭體重為650 kg 左右，安裝有瘤胃瘺管的荷斯坦母牛，采食以稻草（40%）、玉米、豆粕等為精飼料（60%），苜蓿草為粗飼料，每天早晚飼喂2 次（5 kg/d，6：00 和18：00），自由飲水，瘤胃液于晨飼2 h（8：00）后進行采集。將從3 頭牛瘤胃中等量采集的樣本在混合器內混合20 s，分離飼料顆粒中的細菌，用12 層紗布過濾，通入二氧化碳（CO2）30 s，期置于39 ℃水浴鍋，充入N2。

1.2 人工唾液的組成

人工唾液制備后，進行全自動高壓滅菌，最后調整pH值至6.5。人工唾液成分見表1。

表1 人工唾液成分

1.3 試驗處理與培養方法

45 ml瘤胃液濾液與45 ml McDougall's 人工唾液1:1 混合于150 ml 培養瓶中培養。試驗分五組：一組為對照組（CON 組）不添加任何物質；其他四組為試驗組，分別是(SO 組)120 mg 紅花油、（SO-FO 組)120 mg 紅花油+24 mg 魚油,；（SO-FA 組）120 mg 紅花油+24 mmol/l 富馬酸；（SO-FO-FA 組）24 mg 魚油+24 mmol/l富馬酸。將1.2 g飼料(精:粗=7:3)作為營養底物加入到各處理中，用安裝3相閥丁基橡膠塞封住培養瓶，在39 ℃下自動控溫震蕩培養箱內以135 r/min速率厭氧培養12 h。在同樣條件下，每個處理設置3 個平行樣，試驗設置3個重復。

飼料中的化學成分列于表2 中，瘤胃中脂肪酸、飼料和油脂中的添加量列于表3中。

表2 培養液中飼料成分（%，以DM為基礎）

表3 添加到培養液中瘤胃液、混合飼料和油中的C18脂肪酸的濃度(%)

1.4 分析方法

pH值：用pH測定儀測定。

銨態氮的測定：參照Fawcett和Scott(1960)方法用紫外/可見光分光光度計（DU-650）進行測定[16]。

揮發性脂肪酸VFA（乙酸、丙酸、丁酸）濃度的測定：利用氣相色譜法，用已知濃度的VFA 標準品來制作出標準曲線，再利用內標（三甲基乙酸）定量分析。

甲烷（CH4）的測定與計算：利用氣相色譜法，以甲烷標準氣來制作標準曲線再進行分析。計算方法CH4產量參照Lopez和Newbold(2007)方法。

培養液脂肪分離與甲酯化方法：

培養液的脂肪提取液參照Folch's 溶液進行配制，氯仿:甲醇=2:1混合均勻后，取30 ml倒入混合培養液中低溫震蕩24 h，加入C13:0 作為脂肪酸分析內標；在2 000 r/min離心20 min，取下層液體，利用氮吹儀使有機溶劑等揮發，從而萃取脂肪。脂肪酸甲酯化按Lepage和Roy (1986)方法進行[17]。

氣相色譜檢測條件：脂肪酸甲酯（FAME）的檢測利用氣相色譜（安捷倫6890N，自動進樣系統）定量檢測，內標C13:0。脂肪酸計算根據內標法進行定量計算。已知濃度富馬酸和乳酸作為定性與定量分析標準品。

瘤胃微生物RNA 提取與分析：為測定培養液中甲烷生成菌mRNA的表達量，在3 h和6 h的時候取培養液1 ml 于2 ml 小離心管，并立放置在冰塊上以防止微生物的活動，然后分別低速離心（800 r/min，4 ℃，10 min）去除飼料顆粒。收集上清液并再次高速離心30 min 分離出細菌（2 000 r/min，4 ℃）。分離出的細菌沉淀，然后根據多物種RNA 及原核生物RNA 試劑盒說明書中提取方法進行提取與分離，合成cDNA,使用特異性引物來進行熒光定量PCR 分析?；虮磉_的相對定量分析采用2-△△ct方法分析[18]。

1.5 統計分析

數據采用最小二乘方差分析，根據SAS 的線性模型分析，不同處理組之間的顯著性分析按照以下S-N-K`s Test 線性模型分析[19]。

2 結果

2.1 發酵參數和甲烷的產生

如圖1 所示，各處理pH 與培養時間負相關。在3h 時,與其他組相比，SO-FA 和SO-FO-FA 處理組中pH 顯著增加(P＜0.05)。紅花油和魚油對培養液的pH值影響無顯著差異（P＞0.05）。從圖2 結果顯示，所有處理組中的NH3-N隨培養時間的延長而增加。在3 h時,與對照組相比，試驗組甲烷菌的mRNA 表達無顯著差異（P＞0.05）（圖3），在6 h時低于對照組，SO-FO,SO-FA，SO-FA-FO處理組的mRNA表達要比SO處理組的低（圖4）。從表4 可以看出，與其他組相比，SOFA 和SO-FO-FA 兩組丙酸增加顯著，丁酸降低最顯著(P＜0.05)，在12 h 時，與對照組相比，SO-FO, SOFA，SO-FA-FO 處理組丙酸比例下降，其中SO-FA，SO-FA-FO 處理組C2/C3 值降低顯著（P＜0.05）（表4）。與對照組相比，所有處理組總VFA量也與培養時間正相關。3 h 時，SO-FA 和SO-FO-FA 兩個處理組總VFA 產氣量比其他兩處理組產氣量多(P＜0.05)（見表4），并且試驗組中氣甲烷體總量少，且試驗組甲烷的降低量差異顯著(P＜0.05），其中SO-FA-FO 組最少(見表5)，SO 組甲烷量高于SO-FO 和SO-FA，SO-FO和SO-FA 高于SO-FO-FA 組。在12 h 后，SO-FA 和SO-FA-FO 的氣體總量高于SO 組和SO-FO 組(表5)。從表6 中可以看出硬脂酸，反式11，油酸和反式9，油酸的濃度與培養時間正相關，而亞油酸和總共軛亞油酸（CLA），順9，反11-共軛亞油酸和反10，順12-共軛亞油酸與培養時間負相關。與SO 組比較，SO-FO、SO-FA、SO-FA-FO 處理組中硬脂酸和順式11，油酸濃度下降，同時總共軛亞油酸（CLA），順9，反11-共軛亞油酸和反10，順12-共軛亞油酸濃度上升顯著（P＜0.05），其中SO-FA-FO的總共軛亞油酸（CLA）濃度最高，SO-FA-FO 中的順9，反11-共軛亞油酸的濃度高于其他三組（P＜0.05）。

圖1 以紅花油為底物在不同時間內添加魚油和富馬酸對培養液pH值的影響

圖2 以紅花油為底物在不同時間內添加魚油和富馬酸對培養液NH3-N濃度(mg/100 ml)影響

圖3 以紅花油為底物添加富馬酸和魚油在3 h時對甲烷菌mRNA表達的影響

圖4 以紅花油為底物添加富馬酸和魚油在6 h時對甲烷菌mRNA表達的影響

表4 以紅花油為底物添加富馬酸和魚油對培養液中主要VFA濃度和成分的影響

表5 以紅花油為底物在培養12 h內添加富馬酸和魚油對總產氣量和甲烷的影響

2.2 培養液中的富馬酸和乳酸濃度的測定

從圖5 表中可以看出，與其他組相比，在SO-FA和SO-FO-FA 中富馬酸的濃度明顯快速下降（P＜0.05），在3 h后保持平穩。并且在3 h時，與其它處理組相比，SO-FA和SO-FO-FA組中的富馬酸顯著的降低了乳酸的含量（P＜0.05）(圖6)。

3 討論

在本試驗中，在各處理組中補充混合飼料（1.2 g，DM），避免因營養物質短缺而影響瘤胃微生物的正常發酵。從奶牛瘤胃中提取瘤胃液的所有程序確保準確，盡量減少實驗誤差。因此，才能夠正確反映瘤胃微生物的發酵參數，由圖中培養液中隨著時間的增加pH 的降低，氨氮、總揮發性脂肪酸的增加來看，體外發酵是正常的。

從圖1 SO-FA 和SO-FO-FA 中pH 值的增加，可以推斷出富馬酸對瘤胃發酵有積極作用，這與Martin、Streeter(1995)和Li 等(2009)的觀測一致[20-21]。pH值的增加，可能是富馬酸通過瘤胃微生物增加了乳酸的利用率(Nisbet 等，1991，1993)[22-23]，從而降低了乳酸的濃度。SO-FA 和SO-FO-FA 處理組中乳酸的濃度比其它處理組要低，這也與Nisbet 和Martin(1990)研究表明：四倍劑量的富馬酸能夠刺激瘤胃微生物吸收乳酸從而來抑制pH的降低[24]保持一致。

SO-FA 和SO-FO-FA 處理組中總VFA 的濃度增加不顯著，這與Martin(1995)和Li等(2009)研究的添加富馬酸能夠增加VFA 的濃度的結果相似。富馬酸是二元酸丙酸途徑的關鍵前體之一，同時也參與丙酸的代謝途徑。在本試驗中，從表4 可以看出SO-FA 與SO-FO-FA 處理組中C3 比例明顯增加，在培養液發酵3 h后，C3比例的增加與富馬酸濃度的降低密切相關，這表明補充富馬酸有助于瘤胃微生物丙酸的代謝。這與Callaway 等（1996）在體外培養中所得到的結果相似[25]。C3 比例的增加是由于富馬酸的添加影響了H2的代謝途徑，并與甲烷菌競爭利用H2。從表4可以看出，添加油能夠增加C3的比例，而添加魚油的效果比添加紅花油的效果好。Keady 和Mayne 等(2000)研究發現，添加魚油能夠增加瘤胃丙酸的濃度，Van Nevel 等(1974)的研究表明，添加魚油能夠減少甲烷的產生[26]。Demeyer 等報道也證明了甲烷產生的減少往往伴隨著丙酸產量的增加[27]。

表6 以紅花油為底物添加富馬酸和魚油對培養液中主要C18脂肪酸濃度影響（mg）

從表5 中可以看出，單個添加、或者聯合添加都極大的抑制了甲烷的產生，SO，SO-FO，SO-FA和SOFO-FA 處理組與空白對照組中甲烷量相比分別降低了19.68%、42.58%、39.27%和51.90%。甲烷產生的降低與添加的油和富馬酸有關系。當在日糧中添加脂質，會使瘤胃發酵速度減慢，從而使甲烷的生成量減少，這是很常見的。Fievez 等研究表明魚油能夠被作為一種有效地甲烷抑制劑。Czerkawski 等也指出，不飽和脂肪酸可以利用氫進行氫化，從而可以與甲烷的產生形成競爭來抑制甲烷的生成[28]。在本實驗中，紅花油含有大量的亞油酸(C18:2)(占總脂肪酸的61.98%，見表2)。先前也有研究表明，無論在體內還是體外培養實驗中富馬酸都表現出了很強的競爭性，與甲烷菌競爭利用氫[29-31]。在本實驗中富馬酸用來減少甲烷產生效果比較好。從圖3 和圖4 中甲烷菌mRNA 的表達可以得出：添加魚油和富馬酸能夠降低甲烷的產生。從圖5 可以看出，富馬酸在瘤胃微生物中代謝速率很快。在發酵1 h 時SO-FA 和SO-FO-FA 中富馬酸的回收率達到84.63%和86.25%，但是12 h 時幾乎所有的富馬酸被微生物所發酵（99.38%到99.29%）。

圖5 以紅花油為底物添加富馬酸和魚油對培養液中富馬酸濃度（mM）的影響

圖6 以紅花油為底物添加富馬酸和魚油對培養液中乳酸濃度（mM）的影響

在培養1 h 時所有處理中硬脂酸（C18:0）和共軛亞油酸（CLA）及同分異構體(順9，反式11-共軛亞油酸和反10，順式12-共軛亞油酸)濃度成上升趨勢，然而，隨著時間的延長，生物氫化逐漸穩步（見表6）。最高濃度可能表明異構化迅速的發生，此后，生物氫化加速了異構化進程，從而CLA得濃度大大降低了(表6)。油的添加增加了CLA 產生，可能是由于紅花油中含有大量的順9，反11-亞油酸。SO-FO 中順9，反11-共軛亞油酸的濃度比SO 中高，是由于油改變了不飽和脂肪酸氫化的途徑。Wang等人在體外培養實驗中發現魚油和紅花油能夠增加CLA的產生[32]。SO-FA-FO 中c 順9，反11-共軛亞油酸比SO-FO 和SO-FA 中的高，這表明：魚油和富馬酸單獨影響C18:2（亞油酸）氫化過程的能力比兩者聯合的效果差。

4 結論

在本試驗的條件下研究表明，富馬酸和PMUF不影響瘤胃微生物的發酵作用，PMUF 含有多個不飽和雙鍵，而雙鍵的氧化飽和作用又能夠影響亞油酸的生物氫化作用，可以進一步提高CLA 的生成效率，降低甲烷的產量以及甲烷生成菌的mRNA 表達量。富馬酸和魚油能夠改變電子的傳遞途徑，也能夠與甲烷菌競爭性利用氫，同時也能夠影響不飽和脂肪酸氫化的代謝途徑，在培養中CLA 的增加同時也伴隨著甲烷產生的減少。故而，二者協同作用，可以大幅度提高共軛亞油酸（CLA）生成量，大幅度降低甲烷的產量。