Beclin1與UCH-L5及LC3在急性髓系白血病中的表達(dá)及作用研究

苗玉迪 李艷春 李慶瑞

急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是1種源于造血干細(xì)胞癌變的疾病，具有治療困難，容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，當(dāng)前預(yù)后因素對(duì)AML根據(jù)進(jìn)行分型以便于進(jìn)行個(gè)性化治療，可分為低危、中危、高危三種，治療方法通常為先采取誘導(dǎo)化療使病情達(dá)到完全緩解后再行進(jìn)一步化療或骨髓移植。AML的致病原因復(fù)雜至今尚未完全清楚，可能同遺傳學(xué)和環(huán)境因素的作用有關(guān)[1-3]。自噬是細(xì)胞清除問(wèn)題蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程，具體為用囊泡包裹細(xì)胞中問(wèn)題蛋白或細(xì)胞器，然后與溶酶體融合成為自噬溶酶體，逐漸降解內(nèi)部物質(zhì)。自噬能產(chǎn)生細(xì)胞代謝所需的部分物質(zhì)[4]。自噬在不僅存在于機(jī)體正常生理過(guò)程中，在病患時(shí)期也可見(jiàn)，其對(duì)癌癥的發(fā)展所起的作用尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，大多數(shù)白血病細(xì)胞中自噬能力都會(huì)發(fā)生變化。研究表明自噬現(xiàn)象存在于白血病患者骨髓中，自噬缺陷可能可能是骨髓增生異常綜合征MDS向AML進(jìn)展的發(fā)生機(jī)制[5-6]。自噬是由多種基因調(diào)控，自噬相關(guān)基因Beclin1是自噬形成過(guò)程中的可能1種重要的調(diào)控因子，在自噬的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。去泛素化酶UCH-L5是泛素蛋白酶UPS家族一員，研究顯示，其同某些腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，UPS是除了自噬以外的真核生物的另1種蛋白降解方式。微管相關(guān)蛋白LC3參與自噬體的形成，起定位于自噬泡和自噬泡膜表面[8]。 LC3是標(biāo)記自噬體的特異性蛋白，其的表達(dá)強(qiáng)度與細(xì)胞自噬活性關(guān)系緊密。目前在急性髓系白血病中，自噬的發(fā)揮的作用及其機(jī)制尚不明確[9]。本研究擬通過(guò)分析AML患者的Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)情況，探究自噬同AML的關(guān)系，為診斷及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年2月至2018年2月在本院診斷和治療AML患者80例，劃分為AML初發(fā)組和緩解組，初發(fā)組40例，男性22例，女性18例，年齡18～73歲，平均年齡36.7歲；緩解組40例，男性21例，女性19例，年齡21～68歲，平均年齡39.45歲。另選取健康體檢患者40例，男性19例，女性21例，年齡24～70歲，平均年齡37.74歲。AML納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床、血液學(xué)、骨髓細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)，參照《血液病專(zhuān)斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》確診為AML患者，骨髓形態(tài)學(xué)正常；排除標(biāo)準(zhǔn)：患有腫瘤、感染等嚴(yán)重疾病，處于妊娠或生理期女性，臨床病歷資料不全者。研究前向患者詳細(xì)介紹研究?jī)?nèi)容，患者簽署知情同意書(shū)，研究獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，三組患者年齡、性別等一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 主要試劑及儀器

PBS液，淋巴細(xì)胞分裂液(上海博升生物科技有限公司)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，自噬抑制劑3-MA，化療藥物阿糖胞苷，離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司),ABI-Prism7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)定各組基因表達(dá) 獲取健康組、初發(fā)組、緩解組患者脊髓液，抗凝保存。將HL-60細(xì)胞分為對(duì)照組，自噬誘導(dǎo)劑組、自噬抑制劑組、治療組，在IMDM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各自加入100 nmol/l自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA、化療藥物阿糖胞苷，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。RT-PCR檢測(cè)以上各組Beclin1、UCH-L5、LC3的mRNA表達(dá)情況。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)方法 提取RNA。獲取各組患者骨髓液，并與-80 ℃存放備用。取骨髓液、HL-60細(xì)胞培養(yǎng)液各2 ml，經(jīng)抗凝，PBS液處理，加細(xì)胞分裂液，經(jīng)離心機(jī)作用分離單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，于-80 ℃存儲(chǔ)。逆轉(zhuǎn)錄。①合成引物機(jī)探針。從GeneBank獲取ERG、MDR1、BAALC基因堿基序列，應(yīng)用primer express 3.0設(shè)計(jì)引物及探針，各組基因以GAPD作為內(nèi)參，內(nèi)參基因探針及上下游引物:Beclin1上游為5'-GAAGACACAGGAGGCAGT-GG-3',下游為5'-AGGACACCCAAGCAAGACC-3'。UCH-L5上游5'-GGGTCTTCACCGAGiCTCATTA-3'UCH-L5下游5'-AAGTCGGGAGTCCTGAACCA-3'LC3上游5'-AAACGCATTTGCCATCACA-3'LC3下游5'-GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG-3'。GAPDH上游5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'GAPDH下游5'-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。②構(gòu)建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)模板。③ 使用MJ 9700PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR反應(yīng)測(cè)定表達(dá)值。使用ABI 7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀 (美國(guó)ABI公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，生成結(jié)果并分析計(jì)算。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，隨后40個(gè)循環(huán)，94 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s，自動(dòng)收集熒光，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、觀察、照相后獲取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同危險(xiǎn)度分級(jí)Beclin1、UCH-L5、LC3表達(dá)

結(jié)果顯示Beclin1、UCH-L5、LC3在 AML患者中增強(qiáng)，并隨危險(xiǎn)度分級(jí)升高而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同危險(xiǎn)度分層患者的Beclin1、UCH-L5、LC3 mRNA表達(dá)

2.2 不同治療階段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

結(jié)果顯示Beclin1、UCH-L5、LC3在初發(fā)組中表達(dá)增強(qiáng)，并隨危險(xiǎn)度分級(jí)升高而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在緩解組表達(dá)較初發(fā)組減弱(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同治療階段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

注：初發(fā)組與健康組、緩解組比較，P<0.05；緩解組與對(duì)照組比較，P>0.05。

2.3 自噬誘導(dǎo)劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

自噬誘導(dǎo)劑作用后，誘導(dǎo)劑組與對(duì)照組比較，beclin1表達(dá)增強(qiáng)，UCh-L5基因表達(dá)減弱調(diào)，LC-3表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 自噬誘導(dǎo)劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

2.4 自噬抑制劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

自噬抑制劑作用后，抑制劑組同對(duì)照組比較，beclin1表達(dá)減弱，UCh-L5基因表達(dá)增強(qiáng)，LC-3表達(dá)減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 自噬抑制劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

2.5 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

治療AML藥物處理后 AML治療組同對(duì)照組比較Beclin1表達(dá)增強(qiáng)，UCH-L5減弱，LC3增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達(dá)

3 討論

自噬是從酵母到哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞均存在的現(xiàn)象，是1個(gè)把變性的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器通過(guò)溶酶體通路降解的重要細(xì)胞過(guò)程，在應(yīng)激條件下，自噬能為細(xì)胞提供能量，維持細(xì)胞生存[10]。自噬功能具有兩面性，一方面誘導(dǎo)自噬可抑制腫瘤生長(zhǎng)，導(dǎo)致自噬相關(guān)細(xì)胞死亡，另一方便，自噬可為癌細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，清除氧自由基、損傷的線粒體等，能一定程度上維持癌細(xì)胞生存[11-12]。自噬既能抑制癌癥又能促進(jìn)癌癥的兩面性使其在癌癥不同階段發(fā)揮不同作用。自噬抑制癌癥作用表現(xiàn)在癌癥未發(fā)生時(shí)。自噬具有清除損傷的細(xì)胞器，像受損的線粒體，避免其產(chǎn)生大量自由基，為防止基因突變，預(yù)防細(xì)胞癌變做出貢獻(xiàn)。如果自噬能力減弱，會(huì)導(dǎo)致受損DNA數(shù)量升高，直接增加了癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。在癌癥起始階段，自噬功能通常被抑制，以減弱其抑制癌癥的能力，當(dāng)癌癥已經(jīng)發(fā)生時(shí)，自噬憑借其獨(dú)特能力，為維持癌細(xì)胞生存提高幫助。在化療藥物和放療等應(yīng)激條件刺激下，癌細(xì)胞的自噬水平明顯升高以維持癌細(xì)胞生存，在癌癥晚期，自噬活動(dòng)活躍，可能增加癌癥細(xì)胞耐藥性。因此，自噬可能是癌癥的一個(gè)治療靶點(diǎn)，有研究顯示自噬抑制劑聯(lián)合mTORCl抑制劑可作為AML的靶向治療藥物[15]。

Beclin1基因近年來(lái)被認(rèn)為是重要的誘導(dǎo)自噬因子，主要作用于自噬啟動(dòng)階段，是介導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白準(zhǔn)確定位的關(guān)鍵因子，直接參與自噬調(diào)控過(guò)程，是潛在的腫瘤抑制基因[16-17]。本研究顯示，Beclin-1基因AML患者中較對(duì)照組較健康組和緩解組比較呈現(xiàn)出高表達(dá)，同AML的危險(xiǎn)度分級(jí)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，這同自噬在癌癥不同階段的作用是相符的，也驗(yàn)證了自噬在AML中發(fā)揮了作用，說(shuō)明Beclin-1同AML預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。可能原因是由于癌變細(xì)胞面臨更高的代謝壓力，腫瘤細(xì)胞為應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏，通過(guò)Beclin-1提高自噬水平來(lái)維持其存活，在在治療后達(dá)到完全釋解后，也恢復(fù)到正常表達(dá)。UCH-15是去泛素化酶UCH家族的主要成員，同時(shí)也屬于泛素-蛋白酶系統(tǒng)。泛素-蛋白酶體通路主要發(fā)揮和終結(jié)基因和蛋白質(zhì)功能，該通路調(diào)控著包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、降解，基因的轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等幾乎所有動(dòng)植物的生命活動(dòng)[18-19]。本研究中UCH-L5在AML治療的不同階段表達(dá)不同，不同危險(xiǎn)度分層中表達(dá)存在差異，說(shuō)明UCH-L5同AML預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。LC3定位于自噬泡膜表面和前自噬泡，參與自噬體的形成，包括Ⅰ型和Ⅱ型兩種類(lèi)型。未發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)存在的是胞質(zhì)可溶性的Ⅰ型LC3，表達(dá)正常。自噬發(fā)生時(shí)，Ⅰ型LC3與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)化為Ⅱ型 LC3，表達(dá)增強(qiáng)。LC3始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，鑒于其含量與自噬泡數(shù)量相對(duì)應(yīng)，LC3成為了自噬的標(biāo)志性基因[20]。本研究中，LC3表現(xiàn)了同Beclin1一致的表達(dá)現(xiàn)象，清晰的現(xiàn)實(shí)了自噬在AML中發(fā)揮了作用，也說(shuō)明LC3同AML預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。

本研究中，經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA和AML化療藥物阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3的基因表達(dá)均呈現(xiàn)出明顯變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Beclin1、LC3作為自噬相關(guān)基因，表現(xiàn)一致，在誘導(dǎo)劑和化療藥物作用下表達(dá)增強(qiáng)，而在抑制劑作用下表達(dá)減弱，說(shuō)明可以通過(guò)藥物實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬的水平的目的。而化療藥物阿糖胞苷導(dǎo)致自噬標(biāo)志物升高，推測(cè)可能是由于藥物對(duì)癌細(xì)胞造成了很大損傷，短期內(nèi)誘發(fā)癌細(xì)胞增強(qiáng)自噬機(jī)制進(jìn)行抵抗。UCH-L5的表達(dá)變化說(shuō)明自噬抑制劑和誘導(dǎo)劑以及化療藥物可影響UCH-L5的表達(dá)，推測(cè)UCH-L5同自噬機(jī)制存在一定關(guān)聯(lián)。

綜上，可見(jiàn)Beclin1、UCH15、LC3在AML患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與危險(xiǎn)程度分級(jí)正相關(guān)，其表達(dá)同自噬過(guò)程關(guān)系密切，推測(cè)可通過(guò)藥物調(diào)節(jié)三基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬而定目的，進(jìn)而影響AML的治療。