血清miR-221、MMP-2、MMP-9聯合檢測對卵巢上皮癌的診斷意義

薛玲玲 馬會峰

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮內膜癌，而致死率卻位于女性生殖器官惡性腫瘤首位[1]。卵巢上皮癌約占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，因其早期診斷困難，且易發生遠處轉移，導致患者的五年生存率僅約20%[2]。

近年來研究發現，微小RNA-221(microRNA-221，miR-221)與基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)在卵巢上皮癌患者體內存在異常表達，且與卵巢上皮癌的發生、侵襲轉移等過程密切相關[3-5]。在本次實驗中，我們通過比較分析卵巢上皮癌患者與健康女性的血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平，并分析三者與卵巢上皮癌臨床病理特征及發病風險之間的關系，旨在尋找更穩定有效的生物標志物，以期為卵巢上皮癌的診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象的納入與基本資料采集

收取我院2012年9月至2017年12月確診的卵巢上皮癌患者210例為病例組，患者年齡37～73歲，平均年齡(48.6±10.9)歲。其中Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期患者153例。患者均為首次住院且經病理學確診為卵巢上皮癌。卵巢上皮癌的分期參照國際婦產科聯合會制定的FIGO分期系統(2013)[6]。對照組來源于同期在我院行常規體檢的健康女性250例，年齡35～71歲，平均年齡(46.3±11.2)歲。由研究人員對研究對象的BMI、吸煙史、飲酒史等基本資料進行采集。所有研究對象均排除其他系統惡性腫瘤、糖尿病、嚴重的心腦血管疾病及自身免疫性疾病。本研究的開展經醫院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 血清miR-221、MMP-2和MMP-9水平的檢測

受試者禁食10 h以上，次日清晨由專業醫護人員使用含促凝劑采血管抽取靜脈血10 ml，血液標本在1 h內于4 ℃條件下以12 000 g離心力離心15 min，收集上層血清進行相關指標檢測。

血清總RNA的提取按照血液RNA提起試劑盒(中國Bioteke公司)說明書步驟進行。取提取的RNA，使用去除基因組逆轉錄試劑盒(中國Takara公司)逆轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)法檢測血清miR-221及內參基因GAPDH表達水平。檢測過程中所用引物序列如下：miR-221上游引物：5'-AGTGTGTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3'下游引物：5'-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；采用2-ΔΔCt法計算miR-221的相對表達量，△Ct值=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。

血清MMP-2、MMP-9的檢測采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供，檢測儀器為多功能酶標儀DR-3506(無錫華衛德朗)，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 研究對象的基本臨床資料與血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平

病例組和對照組的臨床基本信息與血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平，見表1。兩組在年齡、吸煙史、飲酒史等方面均無顯著差異(P>0.05)。相比于對照組，血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平在卵巢上皮癌患者中顯著升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 研究對象的臨床基本信息與血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平

2.2 血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

如表2所示，血清miR-221、MMP-2和MMP-9水平與卵巢上皮癌患者的年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等因素均無顯著相關性(P>0.05)，而與卵巢上皮癌的FIGO分期顯著相關(P<0.05)，三者水平在Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌患者中的增高最為明顯。

表2 血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平與卵巢上皮癌患者臨床病理特征的關系

2.3 ROC曲線分析

ROC曲線(圖1)分析顯示，血清miR-221、MMP-2和MMP-9在區分卵巢上皮癌與健康女性的AUC分別為：0.887(95%CI：0.822～0.951，P<0.001)、0.784(95%CI：0.701～0.866，P<0.001)、0.704(95%CI：0.613～0.995，P<0.001)；靈敏度和特異度分別為：79.7%/92.8%，63.8%/90.3%，49.3%/86.7%(圖1A/B/C)；診斷界值分別為：8.6(-log)、45.6 pg/ml和30.2 pg/ml。當聯合血清miR-221、MMP-2和MMP-9時，區分卵巢上皮癌與健康女性的AUC為0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，靈敏度為84.1%，特異度為92.3%(圖1D)。

2.4 風險評估

單因素分析顯示，血清高miR-221、MMP-2和MMP-9水平是卵巢上皮癌發病的危險因素；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等因素的影響后，血清高miR-221、MMP-2和MMP-9水平仍是卵巢上皮癌發病的獨立危險因素，見表3。

3 討論

miR-221是1種最新發現的基因調控因子，能在轉錄后水平抑制靶基因的表達或蛋白質翻譯，已被證實在肝癌、胃癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌等多種腫瘤中異常高表達[7-9]。高表達的miR-221通過對其靶基因，如抑癌基因CDKN1B(p27kip1)、CDKN1C(p57kip2)、MMAC1(PTEN)轉錄后負性調控而抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞增殖、遷移[10]。周寧等[11]通過脂質體轉染含有miR-221 sponge的質粒，下調卵巢癌細胞中miR-221的表達水平后，發現卵巢癌細胞的增殖能力與遷移能力會顯著下降。朱小丹等[12]的研究進一步證實，瞬時轉染miR-221 mimics的卵巢上皮癌細胞，其增殖與遷移能力均受到明顯抑制。在本次研究中，我們發現血清miR-221在卵巢上皮癌患者中水平顯著高于健康女性，且在Ⅲ～Ⅳ期患者中的增高最明顯。ROC分析表明，血清miR-221鑒別卵巢上皮癌與健康女性的靈敏度79.7%，表明miR-221對卵巢上皮癌的診斷具有潛在價值。

A為血清miR-221對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線；B為血清MMP-2對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線；C為血清MMP-9對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線；D為聯合血清miR-221、MMP-2和MMP-9對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線。

項目單因素分析OR(95%CI)P多因素分析OR(95%CI)PmiR-221(-log)2.32(1.79～4.31)0.0722.02(1.33～4.41)0.213MMP-2/(pg·ml-1)5.38(2.69～8.91)<0.0014.77(1.47～6.08)<0.001MMP-9/(pg·ml-1)4.61(2.08～6.33)<0.0013.51(1.53～5.72)0.001

MMP-2、MMP-9是癌細胞侵襲、轉移過程中的兩個關鍵酶。二者的激活可以形成Ⅳ型膠原酶，降解細胞外基質，破壞完整的基底膜，促進癌細胞浸潤周圍組織，侵入血管和淋巴管，向遠處轉移[13-14]。目前，關于MMP-2、MMP-9與卵巢癌的相關研究已取得較大進展。申麗媛等[15]對47例卵巢癌、30例卵巢良性腫瘤和21例正常卵巢組織中MMP-2、MMP-9的表達進行檢測發現，MMP-2及MMP-9在卵巢癌中的表達水平均高于正常卵巢組織及卵巢良性組織，且二者與卵巢癌的臨床分期相關。Che等[16]的體外實驗發現，高分泌的MMP-2、MMP-9可通過C3G/Rap1信號通路增強卵巢上皮癌細胞的侵襲能力，這可能是高水平MMP-2、MMP-9預示卵巢癌不良預后的原因之一。在本次研究中，我們證實卵巢上皮癌患者的血清MMP-2、MMP-9水平較健康女性顯著增高，且在Ⅲ～Ⅳ期患者中的增高最為顯著，二者鑒別卵巢上皮癌與健康女性的特異度分別為90.3%和86.7%。當聯合檢測血清miR-221、MMP-2與MMP-9三項指標時，靈敏度高達84.1%，特異度為92.3%，優于單項指標檢測。此外我們還對血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平與卵巢上皮癌發病風險進行了分析，結果表明，高表達的miR-221、MMP-2、MMP-9均為卵巢上皮癌發病的獨立危險因素，提示定期檢測上述三者水平，對卵巢上皮癌的發病具有預測價值。

本研究尚存在以下不足之處：①研究中收集的病例數有限，未來還需更多多中心大樣本的前瞻性研究對本研究結果進行驗證；②本次研究未對miR-221、MMP-2、MMP-9參與卵巢上皮癌發病的機制進行深入挖掘，未來可設計相應的細胞實驗和動物實驗進行探究。

綜上所述，在本次研究中，我們首次探究了聯合檢測血清miR-221、MMP-2、MMP-9三項指標對卵巢上皮癌的診斷與發病風險預測價值，有望為卵巢癌的臨床診療提供新思路。