分蘗洋蔥冰結構蛋白的提取及鑒定

田野，李亞楠，吳征，王紫薇，陳鳳蓮，曲敏

(哈爾濱商業大學食品工程學院黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室,哈爾濱 150076)

植物冰結構蛋白(ice structural proteins，ISPs)，又稱熱滯蛋白(thermal hysteresis protein，THP)或抗凍蛋白(antifreeze protein，AFPs)，是植物體經低溫誘導后產生的抗逆蛋白，普遍存在于寒冷、高海拔地區的越冬植株體內[1,2]，通過控制冰晶生長和抑制細胞外重結晶，以減小大冰晶對機體的損傷。相比魚類和昆蟲ISPs，植物ISPs具有熱滯活性低和較強的重結晶抑制功能[3]，通過范德華表面張力的作用以及可能參與的氫鍵作用使冰核和ISPs緊密結合，從而抑制冰核生長[4]。植物ISPs的起步較晚，19世紀末，Griffith等[5]首次在冬黑麥葉子中分離純化ISPs，隨后在許多多年生的植物，如胡蘿卜(Daucuscarota)、小麥(Triticumaestivum)、女貞葉(Ligustrumlucidum)、苜蓿(MedicagosativaL.)等40余種植株體內檢測出ISPs[6-9]。2006年，我國衛生部公布ISPs可以作為新型食品添加劑添加到冷凍食品中。由于魚類ISPs價格昂貴，不適于在大規模的食品工業加工中應用，因此，探索來源廣泛、價格低廉、食物源的植物ISPs成為研究熱點。

分蘗洋蔥(AlliumcepaL.var.multiplcansBailey syn.var.AgrogatumDon)又名毛蔥或珠蔥，為百合科蔥屬，植株叢生，分蘗能力強[10]。分蘗洋蔥生育期短，適宜在黑土地生長，具有很強的抗寒性，是黑龍江傳統栽培品種[11]。本研究采用冰結合磷酸鹽緩沖溶液法提取分蘗洋蔥冰結構蛋白(Alliumice structural proteins，AISPs)，采用SDS-PAGE確定AISPs的分子量，并將其應用于安琪酵母的抗凍保護中以期得到廉價的植物食物源ISPs，拓寬ISPs的種質資源，并對分蘗洋蔥抗凍機理提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮分蘗洋蔥(市售)：產地黑龍江；安琪耐低糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；磷酸氫二鈉、無水乙醇、甘油、甲醇：天津市天力化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250：上海邁坤化工有限公司；十二烷基硫酸鈉：北京生東科技有限公司；冰醋酸：上海豪申化學試劑有限公司；溴酚藍：沈陽先創化工有限公司；二硫代蘇糖醇：上海前塵生物科技有限公司；Tris buffer：上海葉舟生物科技有限公司；丙烯酰胺、TEMED、蛋白Marker：天津市旭泰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16型高速臺式離心機 上海醫療器械六廠；BCD-216YH電冰箱 美的集團；SDS-PAGE電泳儀、R-205旋轉蒸發儀 北京市君意機電技術公司；UV-紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DL-1冷凍干燥機 寧波市雙嘉儀器有限公司；ESJ 180-4型電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器公司；DYCZ-24DN粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；LG10磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHB-1循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；Motic BA200電子顯微鏡 深圳顯盛儀器有限公司。

1.3 AISPs的提取

1.3.1 提取方法及工藝流程

AISPs提取工藝流程圖見圖1。

圖1 AISPs提取工藝流程圖

1.3.2 單因素試驗

由于ISPs具有能結合于冰表面并與冰形成不可逆的結合特點，本研究采用本組改進的冰結合PBS溶液法提取AISPs。分別考察磷酸緩沖溶液(PBS)的濃度、料液比、冰球添加量對AISPs提取率的影響。

將新鮮分蘗洋蔥去皮，除雜洗凈，切成小塊放入粉碎機中粉碎，并用4層紗布過濾取汁，棄去濾渣。將濾汁于4000 r/min離心5 min，收集上清液。將上清液與PBS溶液混合，在磁力攪拌器作用下連續攪拌1.5 h，設定轉速為800～1000 r/min。采用考馬斯亮藍法測定此時蛋白含量，計算質量，記為M1[12]。

在攪拌提取后的溶液中加入直徑為1 cm的冰球，在-18 ℃環境下靜置2 min，分離出冰球并棄去溶液，收集冰球待自然融化，測量此時蛋白含量，計算質量，記為M2。

待蛋白冰提液于旋轉蒸發儀上濃縮后，在-18 ℃下冷凍，待冷凍透徹后放入冷凍干燥機中制成蛋白質凍干粉。

1.3.2.1 PBS溶液的濃度對AISPs提取率的影響

離心除雜后的分蘗洋蔥濾汁中加入5倍體積pH 8.0的PBS溶液，濃度分別為80，100，120，140，160 mmol/L進行提取，計算蛋白提取率。

1.3.2.2 料液比對AISPs提取率的影響

在離心除雜后的分蘗洋蔥濾汁中加入pH 8.0，濃度為100 mmol/L的PBS溶液，按料液體積比分別為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9進行提取，計算蛋白提取率。

1.3.2.3 冰球添加量對AISPs提取率的影響

分別按每100 mL混合液20，30，40，50，60個的比例加入冰球，在-18 ℃環境下靜置2 min。

1.3.3 響應曲面

根據單因素試驗結果，采用響應面法對AISPs提取工藝進行優化，選取料液體積比(A)、緩沖溶液的濃度(B)和冰球的添加量(C)為考察因素，以蛋白提取率為考察指標，進行響應面試驗，見表1。

表1 響應面分析試驗設計因素與水平

采用BBD試驗設計方法設立17組試驗，各因素和響應面值(蛋白提取率)見表2，對數據進行二次回歸擬合，分析各因素的效應，最后得到AISPs提取最佳工藝。

(1)

式中：M1為冰提前混合液中的蛋白質含量(mg)；M2為冰提后的蛋白質含量(mg)。

1.4 冰結構蛋白全波長掃描

稱取AISPs凍干粉加入蒸餾水配制成濃度為0.5%的蛋白溶液，使用pH 8.0，濃度為91.87 mmol/L的PBS溶液做對照，用UV-紫外可見分光光度計做全波長紫外掃描。

1.5 SDS-PAGE電泳

本試驗根據曲敏等的方法進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.6 AISP對酵母的保護作用

用YPD培養基將市售安琪酵母干粉活化，制成酵母細胞懸液。取5組菌液分別加入0%、0.5%、1%、1.5%、2%濃度梯度的AISPs，將其放入溫度為-18 ℃的冰箱中進行冷凍處理，以1 d為1個周期，凍融5個周期。采用平板劃線法對每個周期的酵母存活數進行測定。用美蘭染劑染色后，于40×顯微鏡下觀察拍照菌體形態。

2 結果與討論

2.1 蛋白標準曲線的測定

圖2 蛋白標準曲線

由圖2可知，蛋白溶液的吸光值與酪蛋白濃度存在正比例關系，線性關系良好，可用于后續試驗。

2.2 PBS溶液濃度對AISPs提取率的影響

圖3 PBS濃度對蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著PBS溶液濃度的增加，蛋白的提取率呈現先增加后降低的趨勢。當PBS濃度在80～100 mmol/L時，洋蔥蛋白所帶的電荷不斷增多，蛋白與水之間的相互作用不斷增大，蛋白與蛋白之間的相互作用不斷減小[13，14]，AISPs提取率逐漸增大。當PBS溶液濃度達到100 mmol/L時，洋蔥蛋白已經達到最大的溶解限度，蛋白中的氫鍵斷裂，提取率達到最大值，為38.15%。表明磷酸溶液濃度的增加有利于分蘗洋蔥中的蛋白更充分地溶解于PBS溶液中，從而提高蛋白提取率。而當提取達到飽和時，增加PBS溶液的濃度，則會導致AISPs提取率下降，綜上，冰法提取AISPs的PBS溶液最適濃度為100 mmol/L。

2.3 料液比對AISPs提取率的影響

圖4 料液比對蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，蛋白的提取率逐漸增大，當料液比達到1∶5時，提取率達到最大值，此后蛋白提取率隨著料液比的增大反而減小。試驗結果表明，料液比的增加有利于分蘗洋蔥中的蛋白更充分地溶解于PBS溶液中[15]。而當料液比大于溶劑用量時，則會導致單位液體中AISPs的含量相對減少，從而降低冰結構蛋白的含量。綜上，冰法提取AISPs的最適料液比為1∶5。

2.4 冰球添加量對AISPs提取率的影響

圖5 冰球添加量對蛋白提取率的影響

由圖5可知，隨著冰球添加量的逐漸增加，蛋白提取率逐漸增高，當冰球添加量達到30個/dL時，提取率達到最大值，此后隨著冰球數的逐漸增加，蛋白的提取率開始下降。這是由于隨著冰球的不斷增加，冰結構蛋白與冰球接觸的表面積不斷增加，有利于冰與冰結構蛋白之間的特異性結合。隨著冰球數量的增加，冰結構蛋白逐漸被提取完全。而當冰球過量時，則相當于在提取蛋白溶液中增加溶劑，使冰結構蛋白濃度降低，導致提取率下降。冰法提取AISPs的最適冰球添加量為30個/dL。

2.5 AISPs提取工藝優化

2.5.1 回歸方程的建立與方差分析

利用軟件對試驗結果見表2。

表2 AISPs提取率響應曲面試驗設計和結果

進行回歸分析，擬合得到AISPs提取率的二次元回歸方程為：

Y=67.01+2.43A+2.83B+2.16C+4.94AB+2.84AC+3.58BC-12.6A2-12.14B2-6.4C2。

(2)

表3 AISPs提取率回歸模型

由表3可知，失擬項不顯著，表明模型的擬合程度良好，未知因素對試驗結果的干擾較少，模型的方差分析說明該模型已經達到顯著水平(P<0.05)。由P值可知各因素對AISPs提取率的影響為：冰球個數>料液比>PBS濃度。校正系數RAdj2為0.95，變異系數(C.V.)為7.33%<10%，決定系數R2為0.98，說明多項式模型的利用性和精密度是可行的，通過此模型方程能預測出AISPs在任何變量值下的提取率。

2.5.2 響應面分析及驗證

因素(料液比、PBS濃度、冰球添加量)交互影響的響應面圖和等高線圖，見圖6～圖8。

圖6 料液比和PBS溶液濃度對蛋白提取率的交互影響

由圖6可知，隨著料液比的增大，冰結構蛋白提取率呈現先增加后緩慢降低的趨勢。PBS濃度為80～120 mmol/L時，提取率呈現先增大后減小的趨勢；等值線區域水平表示料液比與PBS濃度之間具有顯著的交互作用。

圖7 料液比和冰球數量對蛋白提取率的交互影響

圖8 PBS溶液濃度和冰球數量對蛋白提取率的交互影響

由圖7可知，隨著冰球數量的不斷增加，提取率呈現先增大后趨于平穩的趨勢；隨著料液比的逐漸增大，提取率呈現先增大后減小的趨勢。

由圖8可知，隨著PBS溶液濃度的不斷增高，提取率呈現先增大后減小的趨勢。

通過二次多項式回歸分析求最大值，得到AISPs的最佳工藝為：分蘗洋蔥濾汁與PBS溶液的體積比為1∶5.32，PBS濃度為91.87 mmol/L，冰球添加量為32.57個/dL，在此條件下，AISPs提取率的理論預測值為67.753%。結合最優工藝參數和實際生產可操作性，對各因素進行修訂，最終確定最優工藝為：分蘗洋蔥濾汁與PBS溶液的體積比為1∶5.32，PBS濃度為91.87 mmol/L，冰球添加量為33個/dL。在最佳工藝條件下，經過3次重復試驗驗證，AISPs的提取率為65.23%，與預測值相近，說明優化工藝重復性良好，最優工藝的結果可靠。

2.6 全波長掃描結果

圖9 全波長掃描曲線圖

由圖9可知，在波長200～500 nm范圍內對蛋白溶液進行紫外-可見光圖譜掃描，可見AISPs在波長為280 nm處有最大吸收峰，且其他波長處曲線較平緩，未見明顯雜峰，而蛋白溶液的紫外-可見分光光譜的最大吸收峰在280 nm波長附近。可知提取的蛋白純度較高，說明溶液有蛋白質性質，蛋白粉中有微量雜質或小分子肽存在，屬于正常范圍內，進而可以說明本試驗采用AISPs法提取的蛋白純度較高，方法可行。

2.7 AISPs分子量的確定

圖10 SDS-PAGE電泳膠片

注：0為Marker；1,2為AISPs。

由圖10可知，SDS-PAGE電泳結果顯示AISPs由4個蛋白組分組成，其相對分子量分別約為52，29，22，15 kDa。其中，52，22，15 kDa 3個條帶顏色較深，顯示該3個組分含量較高。AISPs條帶較為清晰、筆直顏色較窄，沒有出現明顯的拖尾，說明具有較高的靈敏度和較好的重復性，同時，再次說明冰結合磷酸緩沖溶液法制備的AISPs純度較高，方法可行。

2.8 AISPs對酵母的抗凍保護作用

圖11 耐低糖安琪酵母菌落形態與菌體圖(40×)

注：A為安琪酵母菌落圖(稀釋涂布105倍)；A1為安琪酵母菌體形態圖；B為對照、未加AISPs凍融5 d/次的安琪酵母菌落圖(稀釋涂布105倍)；B1為對照、未加AISPs凍融5 d/次的安琪酵母菌體形態圖(藍色為死亡酵母)；C為1% AISPs、凍融5 d/次的安琪酵母菌落圖(稀釋涂布105倍)；C1為1% AISPs、凍融5 d/次的安琪酵母菌體形態圖。

由圖11可知，耐低糖安琪酵母菌體呈橢圓形，菌落形態為乳白色的半圓珠形，具有光澤，平坦，邊緣整齊。未加AISPs、凍融5 d/次的安琪酵母大量死亡，冷凍使酵母細胞壁遭到破壞，美蘭染液進入細胞，呈現藍色；而加入AISP，大部分酵母在AISPs的保護下仍具有很高的存活率。

圖12 不同濃度AISPs對安琪酵母菌活菌數量的影響

逆境條件下，尤其是冷凍會使酵母的新陳代謝變慢，同時影響酵母細胞的RNA二級結構、蛋白質翻譯率和折疊速率，降低細胞膜的流動性，導致錯誤折疊蛋白質積累、酶失活、營養物質轉運速率和細胞繁殖速率的降低，甚至使細胞處于休眠狀態[16,17]。

由于植物ISPs具有很強的修飾冰晶形態與抑制重結晶的特性，它可以保護細胞免受由低溫造成的破壞，避免體液結為大的冰晶[18]。由圖12可知，在冷凍脅迫條件下，酵母菌落數隨著凍融周次的不斷增加呈不斷下降的趨勢。其中空白對照組在凍融第5周期時活菌數為3.57×105個，存活率為25.89%。而加入不同濃度的 AISP使酵母存活率得到明顯提高，其中1.0% AISPs添加量時酵母菌活菌數最高，菌落數達到6.73×105個，存活率為51.45%，與對照組相比，活菌數提高了88.5%，存活率提高了25.56%。說明AISP對反復凍融的耐低糖酵母細胞具有很好的抗凍保護作用。劉朋帥[19]將小胸鱉甲ISPs(MpAFP698)添加入大腸桿菌菌液中，發現ISPs濃度在0.005～0.08 mmol/L時，保護作用越明顯，與本研究的結論一致。

3 結論

通過單因素和響應面法優化AISPs提取率試驗，得到最佳工藝參數為：分蘗洋蔥濾汁與PBS溶液的體積比為1∶5.32，PBS濃度為91.87 mmol/L，冰球添加量為33個/dL，此時AISPs提取率為65.23%。

全波長紫外掃描AISPs溶液，在280 nm處出現最大吸收峰，說明其具有蛋白性質并且純度較高。利用SDS-PAGE確定了AISPs有4個蛋白組分組成，其分子量分別為52，29，22，15 kDa。

將AISPs添加到耐低糖酵母菌懸液中，當AISPs添加量為1.0%、凍融5 d/次時，酵母菌的活菌數最高，菌落數為6.73×105個，存活率為51.45%，分別比對照組提高了88.5%和25.56%。