UPLC-MS/MS法測定雞肉中氯霉素不確定度的方法

邵棟梁 安徽國科檢測科技有限公司 合肥 230051 Anhui Guoke Test Technology Co., Ltd, Hefei 230051

安徽省科技重大專項項目“安徽省地理標志農(nóng)產(chǎn)品指紋圖譜庫構(gòu)建及區(qū)塊鏈追溯技術(shù)應(yīng)用研究” 18030701203

氯霉素是一種具有旋光活性的酰胺醇類抗生素，是一種高效廣譜的抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用。長期食用氯霉素殘留超標的食品可能引起腸道菌群失調(diào)，導致消化機能紊亂。人體過量攝入氯霉素可能引起人肝臟和骨髓造血機能的損害，導致再生障礙性貧血和血小板減少、肝損傷等健康危害[1]。因此，聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和許多國家限制或禁止氯霉素在畜牧業(yè)中使用。我國《動物性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部公告第235號）中規(guī)定，在所有食品動物中禁止使用氯霉素。

不確定度是反映檢測結(jié)果的準確性與可靠性的指標。檢驗人員通過評定測量不確定度可以進而評價選擇的檢測方法、找出影響測量結(jié)果準確性的主要因素并加以控制，從而提高檢測的準確性。本文以雞肉為例，按照JJF 1059-2012《測量不確定度評定與表示》[2]及國標方法GB/T 20756-2006《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯利考殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[3]評定雞肉中氯霉素檢測的不確定度，為檢測實驗室質(zhì)量控制提供科學、準確的依據(jù)，同時為測量其他獸藥殘留量的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

氯霉素（Chloramphenicol）標準溶液和氘代氯霉素（d5-氯霉素）標準溶液（純度均大于99.2%，德國Dr公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6495)； 電子天平(梅特勒公司，XSE204)，渦旋儀 (IKA公司)； 冷凍離心機(德國貝克曼公司)；超純水發(fā)生器 (Milli Q，密理博公司)。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液和工作溶液的配制

精密稱取10.0mg的標準品，用乙腈定容至10 mL，制備成1.0mg/mL的標準溶液儲備液。精密移取標準儲備液1mL至100mL容量瓶中加入乙腈并準確定容至刻度，得到10mg/L標準溶液中間液，再準確吸取標準中間溶液，加入空白樣品中，經(jīng)前處理后用初始流動相逐級稀釋配制成濃度為0.1、0.5、1、2、5μg/L的標準工作溶液。

1.2.2 前處理方法

稱取5g（精確到0.01g）測試樣品于50 mL離心管中，加入內(nèi)標溶液，加入15mL乙酸乙酯，0.45 mL氫氧化銨，5 g無水硫酸鈉，勻質(zhì)提取30 s，以4000 r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL比色管中。另取一個50mL離心管，加入15mL乙酸乙酯，0.45mL氫氧化銨，洗滌勻質(zhì)刀頭10s，洗滌液移入第一支離心管中，用玻棒攪動殘渣，于液體混勻器上渦旋提取1min，超聲波提取5min，以4000 r/min離心5min，上清液合并至50mL比色管中。殘渣再加入15mL乙酸乙酯，重復上述操作，合并全部上清液至50mL比色管中，用乙酸乙酯定容至50mL。搖勻后移取10mL乙酸乙酯提取液于25mL雞心瓶中，在45℃旋轉(zhuǎn)濃縮至干。雞心瓶中的殘渣用3mL水溶解，超聲5min，加入3 mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加入3mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，移取1mL水相于2mL離心管中，以10000r/min離心5min，過0.22μm濾膜后，供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1×50 mm，1.8μm）； 進 樣 量：5μL； 流 速：0.3mL/min；柱溫：40 ℃；流動相：A相：0.1%甲酸溶液，B相：乙腈；梯度洗脫程序：0～1min，維持10%B；1～3min，10% B線性變至60%B；3～5 min，60%B線性變至90%B；5～7min，維持90%B；7～7.1min，線性變至10%B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），負離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3000 V；干燥氣溫度：230℃；干燥氣流速：17 L/min；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：12 L/min；噴嘴電壓：500 V；霧化氣壓力：25 psi。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氯霉素的主要質(zhì)譜參數(shù)

1.3 數(shù)學模型的建立

根據(jù)測定方法，采用內(nèi)標法定量，按下式計算各被測物含量[4]：

式中：X—試樣中被測物的殘留量，單位為μg/kg；C—樣液中被測物的上機測試濃度,單位為μg/L；V—凈化液經(jīng)氮氣吹干后的定容體積，單位為mL；實驗中V=1mL；m—待測樣品質(zhì)量，單位為 g；

考慮到實驗過程中各種隨機因素對測量結(jié)果的影響，在測量模型中引入重復性系數(shù)frep[5]，建立樣品中氯霉素殘留量不確定度測量模型如下：

由測量模型可看出，影響測定結(jié)果不確定度Urel(X)的主要因素有：制備標準儲備液引入的不確定度U1(Cs)；向空白基質(zhì)樣品中添加標準溶液引入的不確定度U2(Cs)；標準曲線擬合過程的相對標準不確定度Urel(C0)；凈化液經(jīng)氮氣吹干后定容體積引入的不確定度Urel(V)，稱量樣品引入的不確定度Urel(m)，整個實驗重復性（包括提取凈化過程和儀器進樣） 的不確定度通過Urel(frep)來體現(xiàn)。溫度引起的相對標準不確定度很小可忽略不計。

由此得到試樣中被測物的殘留量的相對標準不確定度Urel(X)可由下式計算：

2 結(jié)果

2.1 制備標準儲備液引入的相對標準不確定度U1(Cs)

標準儲備液的不確定度主要由標準品稱量、定容和標準品本身的不確定度決定。

2.2.1 標準品稱量引入的相對標準不確定度U11(Cs)

采用分度值為0.0001g的天平，稱量10.0 mg的標準品。根據(jù)天平檢定證書，該天平的全程法定允許誤差為±0.0002g，按照均勻分布計算，則天平稱量引入的相對標準不確定度為：

2.1.2 標準液定容引入的相對標準不確定度U12(Cs)

100ml容量瓶的定容體積引入的不確定度：試驗使用A級容量瓶，其最大允許誤差為±0.1ml，按照均勻分布計算，則容量瓶檢定引入的不確定度為[6]：

2.1.3 標準品純度引入的相對標準不確定度U13(Cs)

由供應(yīng)商（或證書）提供的標準品純度引入的相對標準不確定度分別為：0.02

制備標準儲備液引入的相對標準不確定度由公式計算：

2.2 向空白基質(zhì)樣品中添加標準溶液引入的不確定度U2(Cs)

空白添加標準曲線的制備：準確稱取5g（精確到0.01 g）空白試樣于50mL離心管內(nèi)，分別稱取5份。分別向其中添加20、100、200、400、1000 μL混合標準工作液（濃度0.01 μg/mL），制得濃度為0.1、0.5、1、2、5 μg/kg的空白添加試料。體積導致的相對標準不確定度的計算方法與3.1（2）是一樣的，即向空白基質(zhì)樣品中添加標準溶液引入的不確定度

2.3 標準曲線擬合過程的相對標準不確定度Urel(C0)

添加5個不同濃度的混合標準樣品0.1、0.5、1、2、5 μg/kg，按樣品處理步驟操作后上機，對應(yīng)上機濃度0.1、0.5、1、2、5μg/L，每一濃度測定2次。各種化合物以上機濃度C為橫坐標，譜圖強度峰面積Y為縱坐標，擬合標準曲線，建立數(shù)學模型：Yi= bCi+a，計算各化合物線性方程的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)，相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

表2 氯霉素回歸直線測量結(jié)果表

被測樣品2次平行測定后，通過擬合直線求出SR和各化合物濃度C0，根據(jù)公式(1)計算出被測樣品中所含各待測物殘留量X0，按(3)式計算各待測物濃度的標準不確定度U(C0)[7]。

其中Yi―標準溶液的峰面積測定值；Ci―標準溶液的濃度值；b―擬合直線的斜率；a―擬合直線的截距；n―標準溶液測定次數(shù)，本實驗室中n=10；p―C0測試次數(shù)，本實驗中p=5；C0―由線性方程計算得各化合物濃度；

擬合曲線導致的相對標準不確定度：

Urel(C0)=U(C0)/C0，有關(guān)量值見表3。

表3 濃度C的不確定度計算的有關(guān)量值表

2.4 定容體積的相對標準不確定度Urel(V)

用移液器定容至1mL，1000 μL移液器移取兩次引入的相對標準不確定度為：

2.5 稱量樣品的相對標準不確定度Urel(m)

稱量樣品的天平最大允許誤差：±5mg，采用均勻分布

2.6 實驗合成重復性的相對標準不確定度Urel(frep)

按實驗方法平行測定樣品5次，測得樣品含量為X1～X5，氯霉素含量的平均值X 測定結(jié)果見表4。

表4 重復性相對標準不確定度Urel(frep)計算結(jié)果表

標準偏差

參照GB/T 20756-2006《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯利考殘留量的測定液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》對蝦肉里的氯霉素含量進行測定，對樣品平行測定5次，取包含因子k=2，

相對擴展不確定度：

Urel(X)=2 Urel(X)=0.0908 (k=2, P=95%)[8]

擴展不確定度：

U(X)/(μg/kg) =0.18(k=2, P=95%)

實測值：

X/(μg/kg) = 0.49

雞肉中氯霉素的含量為：

(0.49±0.18) (μg/kg) (k=2, P=95%)

3 討論

本研究對UPLC-MS/MS法測定雞肉中氯霉素的檢測結(jié)果進行不確定度評定。分析實驗過程中不確定度的來源和影響因素，并進行了各分量的評定。實驗中雞肉中氯霉素含量測定結(jié)果表述為(0.51±0.18) μg/kg (k=2, P=95%)。通過計算比較發(fā)現(xiàn)氯霉素標準溶液配置、標準曲線擬合、檢驗過程的重復性等引入的不確定度對測定結(jié)果不確定度的貢獻較大，在今后的實際檢測工作中檢驗工作者應(yīng)盡可能規(guī)范實驗操作，減少標準溶液的配制步驟、精確配制標準曲線并加強規(guī)范性操作，減少隨機誤差的產(chǎn)生，以提高檢測結(jié)果的準確性。