眠期家蠶抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

楊偉克，唐芬芬，劉增虎，董占鵬

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】抗菌肽(Antibacterial pepetides，AMPs)是一類普遍存在的防御性蛋白質(zhì)，它是一類具有生物活性的小分子多肽，由20～60個氨基酸殘基組成，這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜的抗菌活性，在昆蟲先天免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮了極其重要的作用[1-2]。家蠶幼蟲在眠前停止食桑，排空腸內(nèi)的內(nèi)容物，經(jīng)過一定的時間，機(jī)體生成新皮蛻去舊皮，進(jìn)入下一個齡期。就眠蛻皮是桑蠶生長發(fā)育過程中非常重要的生理特征之一，然而關(guān)于家蠶眠期免疫調(diào)控機(jī)制的研究鮮見報道，因此開展家蠶眠期免疫應(yīng)答模式的研究，探究抗菌肽基因的表達(dá)變化規(guī)律，為豐富和完善昆蟲先天性免疫防御機(jī)制的提供新線索。【前人研究進(jìn)展】家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，其基因組測序已完成，Cheng等通過對家蠶基因組框架圖序列的搜尋找到了35條抗菌肽基因序列[3-5]。目前已確認(rèn)在家蠶基因組中主要存在7個抗菌肽基因家族，即Cecropin、Moricin、Gloverin、Attacin、Lebocin、Enbocin和Defensin家族[6-7]。目前對家蠶抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控的研究報道相對較多，主要集中在外源病原微生物、物理化學(xué)因子或特定的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但這些免疫反應(yīng)均是通過經(jīng)典的Toll或IMD信號途徑調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)[8-10]。在果蠅的先天免疫研究中，研究者發(fā)現(xiàn)饑餓可以調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)，并且不依賴于Toll和IMD信號途徑[11]，筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，饑餓同樣可以誘導(dǎo)鱗翅目昆蟲家蠶抗菌肽基因DefensinB的表達(dá)[12]。昆蟲進(jìn)入眠期發(fā)育時，處于停食的相對饑餓狀態(tài)和對病原抵抗性的相對薄弱環(huán)節(jié)，此時機(jī)體主動提高其細(xì)胞免疫或體液免疫的活性，增強自身免疫力，保護(hù)機(jī)體免受傷害，這有利于昆蟲的正常生長發(fā)育[13-14]。【本研究切入點】一般家蠶的幼蟲期有4個眠期，蠶進(jìn)入眠期主要表現(xiàn)為不吃不動，此時自身的能量代謝會變慢，這在一定程度上會影響相應(yīng)的免疫防御能力。【擬解決的關(guān)鍵問題】家蠶眠期免疫相關(guān)因子和基因表達(dá)調(diào)控的研究少見報道，以四齡眠至五齡起蠶不同發(fā)育階段的血淋巴和脂肪體為實驗材料，測定血淋巴的抗菌活性，同時檢測分析7個抗菌肽基因的表達(dá)變化情況，旨在明確家蠶眠期抗菌肽基因的變化規(guī)律，為深入研究和解析家蠶眠期免疫防御機(jī)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

家蠶品系大造(Dazao)人工孵化，在恒溫培養(yǎng)箱于25 ℃桑葉飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：PCR擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，低溫高速離心機(jī)，Bio-Rad公司CFX-96實時熒光定量PCR檢測儀、恒溫培養(yǎng)箱。主要試劑：高純總RNA快速提取試劑盒(Bioteke公司，貨號RP1202)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，貨號RR047A)，熒光定量試劑(Bio-Rad公司，貨號1725121)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 在家蠶四齡眠期0、12、24 h和眠起(五齡起蠶)取材。用脫脂棉蘸取75 %的酒精進(jìn)行體表消毒、晾干，在冰上用昆蟲針刺其腹足，收集血淋巴，用沸水煮5 min進(jìn)行預(yù)處理，7500 r/min 離心1 min，上清液用于抗菌活性的測定。同時將家蠶表皮剪開，用鑷子刮取脂肪體，保存于1.5 mL Trizol中，液氮保存。根據(jù)高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)操作步驟提取家蠶脂肪體總RNA。用紫外分光光度計測定RNA樣品濃度，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2 血淋巴抗菌活性測定 選用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coliK12D31)為供試菌株。分別取對數(shù)生長期的菌液加入96孔板中，每孔80 μl，加入預(yù)處理的家蠶血淋巴20 μl，終體積為100 μl。設(shè)1個陰性對照和1個陽性對照組，陰性對照組和陽性對照組分別以PBS緩沖液和卡那霉素替代家蠶血淋巴。混勻后用酶標(biāo)儀測OD570值，然后置于37 ℃搖床培養(yǎng)，每隔1 h進(jìn)行測定，利用抑菌曲線表示其抗菌活性。每種處理設(shè)5個重復(fù)，取其平均值。

1.3.3 抗菌肽基因引物設(shè)計 分別選取7個家蠶抗菌肽家族的主效基因，以真核翻譯起始因子4A基因(家蠶芯片探針 ID：sw22934)作為熒光定量內(nèi)參基因運用引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄活性 參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)程序：95 ℃，30 s →(95 ℃，5 s →60 ℃，30 s)40個循環(huán)→65 ℃，5 s(然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃，5 s)。Bio-Rad公司CFX-96實時熒光定量PCR檢測儀記錄實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)文獻(xiàn)報道的公式2-△△Ct計算基因的相對表達(dá)量[15-16]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 用Excel2016和SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 眠期血淋巴抑菌活性檢測

分別取四齡眠0、12、24 h和五齡起的家蠶幼蟲血淋巴，以PBS和卡那霉素作為對照組，測定抑菌活性。從圖1可以看出，四齡眠0 h和五齡起蠶的血淋巴對大腸桿菌沒有抑菌活性，其抑菌曲線與陰性對照組無差異，而四齡眠12 h和四齡眠24 h的血淋巴對大腸桿菌均有顯著的抑菌活性(t測驗，P<0.05)。而圖2結(jié)果表明家蠶四齡眠0、12、24 h和五齡起蠶的血淋巴對金黃色葡萄球菌均沒有抑菌活性。這一結(jié)果暗示四齡眠12和24 h的家蠶血淋巴中產(chǎn)生了某些抑菌物質(zhì)，但其抑菌活性具有選擇性，僅對革蘭氏陰性菌株有抑菌作用。

A：四齡眠0 h；B：四齡眠12 h；C：四齡眠24 h；D：五齡起蠶；CK+：陽性對照；CK-：陰性對照。下同A: The fourth molting for 0 hours; B: The fourth molting for 12 hours; C: The fourth molting for 24 hours; D: The newly molted fifth instar; CK+: Positive control; CK-: Negative control. The same as below圖1 血淋巴對大腸桿菌抑菌曲線Fig.1 The antibacterial curve of hemolymph against Escherichia coli

圖2 血淋巴對金黃色葡萄球菌抑菌曲線Fig.2 The antibacterial curve of hemolymph against Staphylococcus aureus

2.2 cDNA模板檢測

以提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，家蠶管家基因Actin3的引物進(jìn)行普通PCR檢測。結(jié)果如圖3所示，所有cDNA模板均能擴(kuò)增出亮度均一的條帶，說明反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)實時熒光定量PCR實驗。

2.3 家蠶抗菌肽基因的相對表達(dá)量測定

家蠶抗菌肽基因主要在脂肪體組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，隨后分泌到血淋巴中發(fā)揮免疫防御功能[17]。抑菌曲線結(jié)果顯示在四齡眠12和24 h的家蠶血淋巴對大腸桿菌具有一定的抑制活性，表明此時血淋巴中產(chǎn)生了抗菌物質(zhì)。進(jìn)一步利用實時熒光定量PCR對家蠶四齡眠0、12、24 h和五齡起蠶脂肪體的抗菌肽基因進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4所示。抗菌肽基因Lebocin3和Moricin在四齡眠0、12、24 h和五齡起蠶的表達(dá)量均相對較低，并且在測定的時間范圍內(nèi)無明顯變化。Attacin1基因僅在四齡眠24 h表達(dá)量較高。在四齡眠0 h至五齡起蠶這段時間內(nèi)，CecropinB6和Gloverinv2基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢，而Enbocin2和DefensinB的表達(dá)量逐漸升高，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢。這表明在家蠶四齡眠期，抗菌肽基因的表達(dá)規(guī)律并不一致。

M：DL2000 Marker；1～3：四齡眠0 h；4～6：四齡眠12 h；7～9：四齡眠24 h； 10～12：五齡起蠶M:DL2000 Marker; 1-3: The fourth molting for 0 hours; 4-6: The fourth molting for 12 hours; 7-9: The fourth molting for 24 hours; 10-12: The newly molted fifth instar圖3 管家基因Actin3的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The PCR amplification of Actin3

圖4 家蠶抗菌肽基因的表達(dá)變化Fig.4 The expression changes of antibacterial peptide genes in silkworm

3 討 論

鱗翅目模式昆蟲家蠶體液免疫主要是由血淋巴中的脂肪體應(yīng)答外源病原微生物的感染，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽，分泌到血淋巴中發(fā)揮免疫防御功能[17-18]。昆蟲抗菌肽的產(chǎn)生主要通過兩條經(jīng)典的信號傳導(dǎo)途徑(Toll信號通路和IMD信號通路)，其中Toll信號通路主要由真菌和革蘭氏陽性菌激活，而IMD信號途徑主要由革蘭氏陽性菌激活[19-21]。

試驗結(jié)果顯示，家蠶四齡眠12和24 h的血淋巴對革蘭氏陰性菌具有一定的抑菌作用，但對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌卻無抑菌效果，表明此時血淋巴中產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)，并且該抑菌物質(zhì)的抑菌作用具有選擇性。熒光定量PCR結(jié)果顯示，被測試的7個抗菌肽基因出現(xiàn)不同程度的應(yīng)答，其中Lebocin3和Moricin2個基因在四齡眠至五齡起蠶的不同發(fā)育時間段的表達(dá)量無變化，表明這2個基因在眠期不發(fā)揮免疫防御功能，而CecropinB6和Gloverinv2基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢，推測這2個抗菌肽基因在家蠶眠期能量相對匱乏時受到負(fù)調(diào)控。另外Attacin1基因僅在四齡眠24 h出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而Enbocin2和DefensinB基因從四齡眠開始到五齡起蠶這段時間呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢，其表達(dá)量均是逐漸升高。推測在家蠶眠期Attacin1、Enbocin2和DefensinB可能是受到饑餓、激素或是其它信號的正向調(diào)控，促進(jìn)或激活了基因的表達(dá)，主動提高家蠶自身的免疫防御能力。

當(dāng)昆蟲處于饑餓狀態(tài)，機(jī)體能量代謝相對變慢，其自身免疫防御能力會減弱，此時為了防御外來病原微生物的侵染，很有可能會通過其它途徑主動增強自身免疫[13-14]。前期對家蠶的研究發(fā)現(xiàn)，饑餓脅迫能誘導(dǎo)抗菌肽基因DefensinB的表達(dá)，但調(diào)控機(jī)理未知[12]。而在對果蠅免疫研究中發(fā)現(xiàn)，在非感染狀態(tài)下，饑餓可以誘導(dǎo)抗菌肽基因Drosomycin的表達(dá)，并且證實饑餓條件下Drosomycin的表達(dá)既不依賴Toll信號通路也不依賴IMD信號通路，而是通過類胰島素(Insulin-like signaling, ILS)信號水平下降介導(dǎo)FoxO轉(zhuǎn)錄因子(fork-head transcript factor)調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)[11]。家蠶進(jìn)入眠期，不再進(jìn)食，自身代謝變慢，此時機(jī)體處于相對饑餓狀態(tài)，相應(yīng)的免疫力會有所下降或減弱，推測機(jī)體通過其它途徑誘導(dǎo)抗菌肽等免疫蛋白的產(chǎn)生，主動增強自身免疫，其調(diào)控原理及機(jī)制是否與果蠅相似，有待進(jìn)一步去探究和證實。

4 結(jié) 論

家蠶四齡眠12和24 h的血淋巴產(chǎn)生了具有選擇性的抑菌活性物質(zhì)，并且僅對革蘭氏陰性菌具有一定的抑菌作用。在四齡眠至五齡起蠶的不同發(fā)育時間抗菌肽基因Enbocin2和DefensinB的表達(dá)量逐漸增加，而Attacin1僅在四齡眠24 h出現(xiàn)高表達(dá)，提示這3個抗菌肽基因在家蠶眠期發(fā)揮了重要的免疫防御功能，但其免疫調(diào)控機(jī)理還不明確。