云南疣粒野生稻原生質體高效分離培養體系的建立

陳 越，王玲仙，付 堅，陳 玲，肖素勤，柯 學，鐘巧芳，趙才美，余騰瓊，王 波，張敦宇，殷富有，程在全*

(1. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室, 云南 昆明 650205；2. 云南大學, 云南 昆明 650223)

【研究意義】疣粒野生稻(OryzameyerianaBaill.) 是中國三種野生稻之一，主要分布于中國的云南省及海南省，由于長期處于野外條件下適應各種不良環境及逆境變化形成了天然的基因庫，具有許多優異的抗性基因資源。據文獻報道疣粒野生稻對白葉枯病、稻瘟病、稻飛虱等多種病蟲害具有較高的抗性，這些特性在水稻抗性育種中具有重要意義。有研究報道疣粒野生稻比藥用野生稻(OryzaofficinalisWall. ex Watt.)和普通野生稻(OryzarufipogonGriff.)具有更優異的抗性遺傳特性[1]。然而疣粒野生稻屬于GG基因組與栽培稻的AA基因組，存在生殖障礙，采用常規雜交方法無法利用疣粒野生稻的優異基因[2]。植物原生質體作為基因轉移的理想受體，是進行基礎理論研究的良好材料，利用它可以快速對目的基因進行功能分析，實現體細胞雜交、基因導入以及創造新種質或改良農作物品種[3]。因此，利用原生質體培養途徑可有效發掘疣粒野生稻的優良遺傳特性，為實現稻種種質資源創制提供材料基礎。【前人研究進展】1892年，Klercker等[4]通過機械分離的方法首次從一種藻類植物中分離出少量原生質體。1960年Cocking等[5]以番茄根尖為實驗材料，用酶解法分離出大量有活力的原生質體，極大地推動了植物原生質體的研究。1971年，Nagata等[6]通過培養煙草葉肉原生質體獲得再生植株，首次建立了從原生質體到完整植株的實驗體系。隨著植物原生質體與細胞、分子和遺傳學科的交叉滲透，使植物原生質體成為研究的熱點。近年來，關于單子葉植物—水稻的原生質體相關的報道越來越多[7]，然而，相對于雙子葉植物，單子葉植物的結構較為復雜，使得其原生質體的制備相對來說比較困難。1985年，Fujimura等首次培養出水稻原生質體再生植株，隨后原生質體培養再生植株在一些重要的單子葉作物如高粱、玉米、小麥等作物上相繼報道，但缺乏對原生質體制備及植株再生培養的系統研究[8]。開展植物原生質體研究的首要條件就是要有大量有活力的原生質體。【本文研究切入點】本研究以單子葉植物云南疣粒野生稻為實驗材料，對其原生質體制備和培養過程中影響產量和活力的重要因素，如酶解液組合及濃度、酶解時間、滲透壓穩定劑濃度等進行有效的篩選[9-11]。【擬解決的關鍵問題】通過對云南疣粒野生稻原生質體的制備和培養，建立快速獲得云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞系的實驗方法，篩選出酶解獲得原生質體的酶的種類、濃度、酶解時間、滲透壓穩定劑的濃度等，形成一套快速酶解云南疣粒野生稻原生質體的完整體系，進而建立云南疣粒野生稻原生質體培養得到再生植株的體系。為今后以疣粒野生稻原生質體為材料的其他分子生物學操作提供材料基礎，也為其他相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為采集于云南省玉溪市元江縣的疣粒野生稻成熟種子。

1.2 云南疣粒野生稻懸浮細胞的培養

云南疣粒野生稻的成熟種子去穎殼后置于超凈工作臺中，用75 %乙醇表面消毒1 min，無菌水清洗4～5次，10 %的次氯酸鈉消毒18 min，無菌水清洗8～10次，再用10 %次氯酸鈉消毒10 min，無菌水清洗8～10次。最后將滅菌處理后的云南疣粒野生稻種子置于無菌吸水紙上吹干后接于N6誘導培養基(N6培養基+2,4-D 3.0 mg/L+蔗糖30 g/L+MES 0.5 g/L+植物凝膠2.8 g/L，pH 5.8)上。在28 ℃條件下暗培養，經40～60 d，待長出愈傷組織，選取淡黃色塊狀顆粒，切下胚乳和長出的小芽，只保留愈傷組織，將其轉接到N6繼代培養基(N6培養基+2,4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+MES 0.5 g/L+植物凝膠2.8 g/L，pH 5.8)上，繼代培養3次以上，得到性狀穩定的云南疣粒野生稻愈傷組織。

選取0.48 g質地堅硬、結構致密、淡黃色顆粒分散的胚性愈傷將其接入裝有30 mL N6液體培養基(N6培養基+2,4-D 2.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+MES 0.5 g/L，pH 5.8)的三角瓶中進行懸浮培養[12]。將懸浮培養物置于搖床上，28 ℃，110 r/min，暗培養，每5 d繼代1次，每次繼代時傾去約2/3體積的上清液，補充N6液體培養基至30 mL繼續培養。在懸浮培養繼代2次后，每次繼代時根據培養階段及懸浮細胞顆粒的大小依次選擇10、20、40目孔徑的不銹鋼篩網對懸浮培養的細胞進行過濾，濾去大細胞團和一些死細胞，只留下大小均一的懸浮細胞，懸浮培養45～60 d后，建立起云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞系。

1.3 云南疣粒野生稻原生質體的分離純化

用60目的不銹鋼篩網(提前用0.6 M甘露醇潤洗)過濾云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞，過濾后以800 r/min離心1 min收集懸浮細胞，收集的懸浮細胞按1︰10比例放入不同濃度組成混合酶液中，經60目不銹鋼篩網(提前用酶混合液潤洗)過濾，過濾后在27 ℃，70 r/min上振蕩酶解。酶解完成后用300目不銹鋼篩網(提前用0.6 M甘露醇潤洗)過濾酶解液，過濾后靜置3 min，離心收集原生質體，然后用0.6 M甘露醇洗液洗1次，再用原生質體培養培養基(N6培養基+B5維生素+水解絡蛋白 0.5 g/L+甘氨酸 2 mg/L+谷氨酰胺 146 mg/L+葡萄糖 90 g/L+MES 975 mg/L+2,4-D 1 mg/L，pH 5.8)清洗1次，清洗的過程動作要輕柔。以上用于原生質體制備和分離的試劑、培養基均經0.22 μm微孔濾膜過濾滅菌處理，現配現用。

1.3.1 酶解時間對云南疣粒野生稻原生質體產量和活性的影響 酶解云南疣粒野生稻的懸浮細胞(酶溶劑為0.6 M的甘露醇)，酶液成分：2 % 纖維素酶(Cellulase Onozuka RS)，0.2 % 果膠酶(Pectolyase Y-23)，MES 5 mM，甘露醇 0.6 M，CaCl25 mM，pH 5.8(纖維素酶和果膠酶參照文獻[12])，酶解時間設置為0.5、1、2、3、4、5 h。酶解完成后測定分離出疣粒野生稻原生質體的產量和活力，確定其最佳的酶解時間。

表1 酶解液組合

1.3.2 不同酶液組合對云南疣粒野生稻原生質體產量和活力的影響 酶解液共設6個組合(表1)，每個酶解液組合分別加入1 g云南疣粒野生稻懸浮細胞，在優化出的最佳酶解時間范圍進行酶解，每個處理3次重復，測定分離出的云南疣粒野生稻原生質體的產量和活力，篩選最適酶液組合。

1.3.3 緩沖液濃度對云南疣粒野生稻原生質體產量和活力的影響 優化出最適酶解時間、酶解組合及濃度后將疣粒野生稻的懸浮細胞分別轉入甘露醇濃度為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 M的最適酶液組合中進行酶解，測定各個緩沖液濃度下原生質體產量和活力，確定最適的甘露醇濃度。

1.4 云南疣粒野生稻原生質體產量及活性的測定

利用血細胞計數板測定疣粒野生稻原生質體產量，在顯微鏡下觀察計數，重復4～5次，計算出1 mL中的原生質體數。將原生質體的密度用原生質體培養基調至0.5～1.0×105/mL，備用。

原生質體的數量=1個大方格的懸浮液(0.1 mm3)中的細胞數×104。

對純化后的原生質體進行活力測定。每 5 mL云南疣粒野生稻原生質體加入0.1 μg/mL FDA，靜置10 min后在熒光顯微鏡下觀察，有活力的原生質體會發出綠色熒光。在明場暗場下各選取3個視野統計原生質體的數量及活力。

1.5 云南疣粒野生稻原生質體植株的再生

調整分離純化的云南疣粒野生稻原生質體的密度并重新懸浮在液體培養基中，分別用液體淺層培養和固液培養的方式對云南疣粒野生稻的原生質體進行培養，以篩選出培養云南疣粒野生稻原生質體的最適培養基。液體淺層培養所用的培養基：N6培養基+B5維生素+水解絡蛋白 0.5 g/L+甘氨酸 2 mg/L+谷氨酰胺 146 mg/L+葡萄糖 90 g/L+MES 975 mg/L+2,4-D 1 mg/L，pH 5.8)。固液培養則先在培養皿底部淺鋪一層改良了的N6固體培養基(N6培養基+B5維生素+L-脯氨酸1 g/L+水解絡蛋白1 g/L+蔗糖30 g/L+MES 0.5 g/L+植物凝膠 2.8 g/L，pH 5.8)，再將懸浮于液體培養基中的原生質體均勻鋪于固體培養基上即可，于溫度28 ℃的培養箱中黑暗條件下進行培養。培養7 d后每周添加含3 %葡萄糖的液體培養基，定期觀察云南疣粒野生稻原生質體在不同培養基上的生長情況。待再生可見的細胞團長至直徑1.5～2 mm大小時，每周添加液體培養基直到再生細胞團長至4 mm大小，將其接入2,4-D濃度為1.5 mg/L改良了的N6固體培養基中進行繼代培養，待其長至5 mm時將其轉至N6分化培養基中，因分化材料為原生質體再生細胞團故對N6分化培養基做了相應改良，改良后的配方：N6培養基+6-BA 4 mg/L+ZT 1 mg/L+KT 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+水解絡蛋白 3 g/L+L-脯氨酸 1 g/L+Ficoll 2 g/L+蔗糖 20 g/L+植物凝膠 2.8 g/L，pH 6.0，在培養箱中28 ℃，光照12 h，光強4000 lx，再生苗長至1～2 cm時，將光強降至3000 lx。當再生苗長至3 cm時將其接入生根培養基中進行培養，培養基配方：N6培養基+NAA 0.4 mg/L+Ficoll 3 g/L+蔗糖 10 g/L+植物凝膠 2.8 g/L，pH 6.0，在培養箱中光照12 h，光強為 2500 lx，28 ℃培養。待再生苗的主根長至2 cm，須根長至1.5 cm時，從生根培養基中取出生根苗，用自來水沖洗，將其根部的培養基洗凈后用水將生根苗根部淹沒，放置于光照12 h，光強為 2500 lx，28 ℃進行煉苗培養，7 d后將鍛煉苗移栽于土中。

2 結果與分析

2.1 云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞系的快速建立

將云南疣粒野生稻愈傷組織加入到含有N6液體培養基的三角瓶中，經過45～60 d獲得如沙塵狀分散度極高無褐化的細胞團即云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞系(圖1A)，顯微鏡下觀察發現，此時懸浮細胞大小均一，細胞形態為橢圓形，細胞質濃厚(圖1B)，細胞形態與向太和等[10]所描述的適合做原生質體培養的胚性懸浮細胞系相似。

2.2 酶解時間對云南疣粒野生稻原生質體分離效果的影響

酶解獲得原生質體的效果與酶解時間密切相關，酶解時間過短、酶濃度過低，均會造成酶解不充分，從而影響原生質體的產率和質量；如果酶解時間過長，酶解液會對原生質體產生一定的毒害作用導致原生質體的產率和質量也會下降。云南疣粒野生稻懸浮細胞在酶液中酶解0.5～5 h后原生質體的產量和活力見圖2～3。酶解0.5、1、5 h疣粒野生稻原生質體產量均較其他幾個時間段要低，酶解3 h時云南疣粒野生稻原生質體的產量最高，酶解2 h時原生質體的產量和活力均較高，綜合考慮產量和活力因素，2 h為云南疣粒野生稻原生質體的最適酶解時間。

A: 云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞系；B:云南疣粒野生稻懸浮細胞鏡檢圖A: The embryogenic suspension cell lines of Oryza meyeriana Bail.; B: The microscopy of embryogenic suspencion cells圖1 云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞Fig.1 Embryonic suspension cells of Oryza meyeriana Bail.

2.3 不同的酶液組合對云南疣粒野生稻原生質體產量和活力的影響

適宜的酶種類及濃度組合是獲得高質量原生質體的保障，云南疣粒野生稻原生質體在不同的酶液組合中酶解2 h后的分離效果差異較大。從表2中可看出，酶的種類和濃度會影響原生質體的產率和活力，綜合比較各個酶液組合對原生質體酶解的效果發現1.5 % 纖維素酶+0.3 % 果膠酶組合可使原生質體的產量達到1.45×106個/g·FW，活力達到90.17 %。因此，選擇此濃度組合用來酶解云南疣粒野生稻的懸浮細胞。

圖2 不同酶解時間處理下云南疣粒野生稻原生質體的產量Fig.2 The protoplast yield of Oryza meyeriana Baill. at different enzymolysis duration

2.4 酶解云南疣粒野生稻懸浮細胞滲透壓穩定劑濃度的篩選

對不同濃度甘露醇緩沖液處理的原生質體的顯微觀察發現，以甘露醇緩沖液濃度為0.4和0.5 M處理時，云南疣粒野生稻的原生質體破裂程度較大，且細胞較為膨脹，可能這兩個濃度的甘露醇緩沖液低于疣粒野生稻原生質的體滲透壓，導致細胞大量吸水膨脹破裂；而以0.7和0.8 M甘露醇緩沖液處理的云南疣粒野生稻原生質體的細胞碎片較多，且細胞多為萎蔫皺縮狀態，說明這兩種甘露醇緩沖液濃度較高，造成大部分細胞脫水。只有以0.6 M甘露醇濃度處理的云南疣粒野生稻原生質體狀態較好，且視野中細胞碎片較少(圖4A)。

將不同甘露醇濃度酶解純化的原生質體用0.01 % FDA染色在5倍鏡下顯微觀察原生質體的活力，經FDA染色后活細胞在熒光顯微鏡下發綠色熒光，而死細胞則不著色(圖4B)，在3個視野下統計活細胞的數量。從圖5～6中可以看出，云南疣粒野生稻在0.6和0.7 M處理下均得到了較高的產量，而以0.6 M甘露醇處理時它的原生質體活力較高(此結果與顯微鏡下觀察的一致)，說明0.6 M甘露醇是獲得云南疣粒野生稻原生質體較適宜的緩沖液濃度。

圖3 不同酶解時間處理下云南疣粒野生稻原生質體的活力Fig.3 The protoplast viability at different enzymolysis duration

表2 不同酶解液濃度組合酶解獲得的云南疣粒野生稻原生質體產量及活力

2.5 云南疣粒野生稻原生質體培養及植株再生

對云南疣粒野生稻原生質體分別采用液體淺層培養和固液培養5～10 d后均可用肉眼觀察到細胞團。通過實驗發現液體淺層培養前15 d細胞生長較好，有明顯的再生細胞，但這些細胞在一段時間后就不再分裂，最終也沒有長成愈傷組織。固液培養方法培養疣粒野生稻原生質體，一般12～24 h原生質體恢復細胞壁，并且重新形成小細胞團(圖7A)，2～4 d發生細胞第1次分裂(圖7B)約2個月長至直徑1.5～2 mm的細胞團(圖7C)，繼續培養愈傷組織到3 mm時將其接入繼代培養基中，經一段時間的繼代、分化、生根培養得到云南疣粒野生稻原生質體再生植株，具體過程見圖8。

圖4 0.6 M甘露醇滲透壓獲得云南疣粒野生稻原生質體經FDA染色圖Fig.4 FDA staining of protoplasts at 0.6 M mannitol osmotic pressure

圖5 不同甘露醇濃度處理下云南疣粒野生稻原生質體的產量Fig.5 Protoplast yield of Oryza meyeriana Baill. at different mannitol concentrations

圖6 云南疣粒野生稻原生質體在不同甘露醇濃度處理下的活力Fig.6 The protoplast vitality of Oryza meyeriana Baill. at different mannitol concentrations

A：疣粒野生稻原生質體再生細胞團；B：原生質體復壁后細胞第1次分裂；C：疣粒野生稻原生質體再生微愈傷組織A: Regenerated cells of the protoplasts; B: The first division of cells after the reconstruction of the protoplasts; C: Regenerated micro callus of the protoplasts圖7 云南疣粒野生稻原生質體的培養Fig.7 Protoplasts of Oryza meyeriana Baill. cultivation

A：原生質體發育的愈傷組織的分化培養；B、C：原生質體再生的小苗：原生質體再生苗；D：原生質體再生植株A: Callus culture from the protoplasts; B,C: Regenerated plantlets; D: Regenerated plants圖8 云南疣粒野生稻原生質體再生苗成長全過程Fig.8 The regeneration process of plants from the protoplasts of Oryza meyeriana Baill.

3 討 論

3.1 影響云南疣粒野生稻原生質體產量和活力的因素

植物原生質體是沒有細胞壁包裹的，具有活力和全能性的細胞，原生質體在細胞雜交，基因導入以及創造新種質方面均有很大潛力。單子葉植物水稻原生質體的獲得較雙子葉植物困難，一般需借助胚性懸浮細胞培養體系分離而來。懸浮細胞系是一些沒有個體差異、生長狀態基本相同且遺傳背景相同的細胞群體，懸浮細胞的生長條件容易控制，具有較好的細胞全能性，是作為細胞研究的良好材料。

建立植物胚性懸浮細胞系可以根據不同植物的特點選擇MS液體培養基、N6液體培養基和AA培養基。在實驗中發現AA培養基營養太過于豐富易造成懸浮細胞的褐化且相對于N6培養基，AA培養基培養的水稻懸浮細胞增值速度較慢與朱根發等[11]的研究一致。因此，本文在培養云南疣粒野生稻懸浮細胞時采用添加了2,4-D 2.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+MES 0.5 g/L的N6液體培養基，對比發現用此培養基培養的云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞不易褐化，而且在培養的各個階段保持培養基的一致性更有利于懸浮細胞的生長。懸浮細胞繼代2次后在培養的不同階段根據懸浮細胞的大小依次用10、20、40目孔徑的不銹鋼篩網對懸浮培養的細胞進行過濾，只留下大小均一的懸浮細胞。用此法只需45～60 d即可建立起良好的胚性懸浮系，比藺忠龍等[12]和朱永生等[13]建立水稻懸浮細胞系的周期3～4個月縮短了1個多月的時間。因懸浮細胞的培養對實驗操作要求較高，需每5～7 d在超凈工作臺中進行繼代，且繼代過程中材料極易污染，建立胚性懸浮細胞系周期的縮短大大降低了反復多次操作造成材料污染的風險和實驗的工作量。

果膠酶、纖維素酶及半纖維素酶等是植物原生質體分離過程中常用的酶，酶的組合、酶的濃度及酶解時間對分離原生質體的效果有很大的影響[14]。蔣友燊等[14]以9種酶液分離百脈根的原生質體，發現酶濃度和酶解時間與原生質體的產量成正比，與其活力成反比。段煉等[15]用生長12 d的水稻幼苗的葉和莖在纖維素酶和果膠酶的共同作用下酶解4 h，得到的水稻原生質體產量為1.68×107個/g·FW，活力在66.7 %以上。Rebecca Bart等[16]用1.5 % 纖維素酶+0.75 % 果膠酶+0.1 % BSA酶解生長14 d的水稻葉片4 h，得到的原生質體數目為1～5×105個/g·FW，活力接近100 %。本文在收集懸浮細胞和酶解前分別用60目的不銹鋼篩網過濾云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞，此法既可濾去大顆粒懸浮細胞及細胞團，又可以令小顆粒細胞團分散開，使其在酶解時可以充分與酶液接觸，縮短酶解時間，防止酶解時間過長對細胞的毒害。過濾后的懸浮細胞分別在6種酶液組合中進行酶解，2 h后酶解組合1.5 %纖維素酶+0.3 %果膠酶所獲得的云南疣粒野生稻原生質體的產量可達1.45×106個/g·FW，活力為90.17 %，相比較其他酶液組合要高。有報道指出，原生質體離體的時間越長，其生理功能、活性就越低[15]，此方法可在較短的時間內酶解出產量和活力俱佳的原生質體，既保證了后續實驗體系的有效性，又節約了實驗時間。

原生質體的產量和活力除了與酶的種類、酶的濃度、酶解時間及酶解的操作方法有關，還與維持原生質體膜穩定和完整的酶溶劑及純化溶液中的滲透壓有關，常用的滲透壓穩定劑為葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇[17-18]。本文參照向鳳寧[19]分離和純化小麥原生質體的方法，并對滲透壓穩定劑甘露醇的濃度進行篩選，發現疣粒野生稻原生質體在甘露醇濃度為0.6 M時產量和活力較高，在顯微鏡下可見呈圓形或橢圓形邊緣清晰的球狀原生質體，視野內碎片較少，用FDA檢測時有活力的原生質體發出綠色的熒光，這與Oliveira等[20]得出的0.55～0.6 M甘露醇濃度適宜于原生質體分離的結果基本相似。

3.2 云南疣粒野生稻原生質體再生植株的培養方式

不同的原生質體采用的培養方法也有差異，常用的方法為液體淺層培養和固液雙層培養等。液體淺層培養，便于添加新鮮培養基，但其具有流動性，難以跟蹤觀察某一細胞的生長分裂情況，且原生質體分布不均勻；固液培養有利于固體培養基中的營養成分緩慢地向液體培養基釋放，同時原生質體代謝所產生的有害酚類物質也可被固體培養基吸收，有利于細胞的持續分裂。本文在對比兩種培養方式對疣粒野生稻原生質體培養效果時發現，固液培養的原生質體可以得到細胞團并由細胞團進一步發育為原生質體的再生植株，與陳愛萍等[21]在對‘新牧4號’紫花苜蓿原生質體培養時認為固液培養更適合苜蓿原生質體的分裂與培養的結果一致。

4 結 論

通過制備原生質體實驗體系的優化，建立了快速獲得云南疣粒野生稻胚性懸浮細胞系的實驗方法，并篩選了獲得原生質體的酶的種類、濃度、酶解時間、滲透壓穩定劑的濃度等，形成一整套快速酶解云南疣粒野生稻原生質體的體系，建立了較適合云南疣粒野生稻原生質體的培養方式，并得到了再生植株。以上研究結果對以疣粒野生稻原生質體為材料的基因功能、細胞生理功能、細胞工程、改良品種及種質創新研究具有重要的意義。