水稻磷脂酶PLD家族生物信息學分析

康偉偉，張 超，2，易自力，陳智勇，譚炎寧

(1. 湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙 410125)

【研究意義】磷脂酶廣泛存在于動植物中，具有磷脂酶A1、A2、B、C和D等類型，它們能特異地作用于磷脂分子的各個酯鍵，將其水解為脂肪酸及親脂性物質[1]。植物磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)即磷脂酰膽堿磷脂水解酶(EC3. 1. 4. 4)，其作用底物較為寬廣(如底物有磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等)，能專一性水解磷脂中的4位酯鍵生成磷脂和有機堿[2]，在脂質代謝、生物膜形成、信號轉導以及逆境響應方面發揮著重要作用[3]。【前人研究進展】PLD作為植物磷脂酶家族的重要組成亞類，其結構和功能越來越受到關注。擬南芥基因組中共存在12個PLD成員，根據其序列相似性及蛋白結構域的不同被分成α、β、δ、γ和ζ等5種不同的亞型[4]。水稻PLD含有17個成員，預測其中16個為擬南芥PLD的同源蛋白，剩余一個在水稻中未被編碼；水稻PLD比擬南芥增加了φ和κ兩種亞型[5]。有趣的是，φ型PLD并不具有C2結構域或PX/PH結構域而含有一段信號肽，因此也被稱為信號肽PLD(SP-PLD)[4-5]；φ型PLD已在葡萄、楊樹等多種植物中相繼被發現[6]。目前，多項研究發現擬南芥PLD參與干旱、鹽和低溫等脅迫應答。過表達AtPLDα1基因提高了植株對脫落酸ABA的敏感性，促進氣孔關閉，減少水分蒸騰散失，從而增強了植株的抗旱能力，而敲除株系則表現出相反的性狀[7-8]。在鹽脅迫條件下，AtPLDα1和AtPLDδ基因被激活；AtPLDα1的突變株出現了生長缺陷，AtPLDα1、AtPLDδ的單突變體及其雙突變體對鹽敏感性增加[11,14]；類似地，番茄LePLDα1在鹽脅迫下被誘導表達，其突變細胞在鹽脅迫下活性顯著降低[11,15]；擬南芥AtPLDα3也被報道參與了鹽、脫水和ABA的響應[10]。AtPLDδ與低溫響應有關，AtPLDδ突變株在-7 ℃或更低溫度條件下其存活能力明顯低于野生型[11,16]。【本研究切入點】在水稻中，OsPLDζ1受鹽誘導表達，OsPLDζ1的突變株在鹽脅迫條件下生長發育明顯緩慢，植株矮化且存活率下降[17]；OsPLDβ1通過激活ABA信號通路，抑制種子的萌發[18]。與之相反，OsPLDα3突變株在鹽脅迫條件下比野生型呈現出更好的生長狀況，表明OsPLDα3在鹽脅迫響應中具有負調控作用[17]。但是目前，水稻PLD家族基因功能的研究相對較少。【擬解決的關鍵問題】為了加強對該基因家族的深入認識，本研究利用生物信息學手段分析了水稻16個磷脂酶PLD家族成員的基因結構、蛋白域基序、時空表達以及激素誘導表達模式，旨在為進一步研究該家族的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻PLD家族基因結構分析方法

從Amarjeet Singh(2012)文獻中獲得水稻PLD家族基因的登錄號，通過在RGAP網站上搜尋并下載其基因組序列和CDS序列，然后在GSDS(Gene Structure Display Server 2.0)網站分析基因結構。

1.2 水稻PLD家族蛋白基序分析方法

在Ensembl Plants網站上搜尋并下載水稻OsPLD家族蛋白序列，利用在線分析網站MEME(http://meme-suite.org/)分析基序種類與特征。

1.3 水稻PLD家族時空表達與激素誘導表達分析方法

從RiceXPro網站所公布4X44K Microarray芯片數據中提取OsPLD家族基因在葉、葉鞘、莖、根、花藥、子房等不同組織部位及營養時期、生殖時期和成熟期等不同發育時期的表達數據，進行標準化處理；此外，利用該數據庫調取以種子萌發至生長7 d的水稻嫩芽為樣本的激素(如脫落酸、赤霉素、生長素、油菜素內酯、細胞分裂素和茉莉酸)處理表達數據，經歸一標準化處理后使用MeV4.6作圖，得到PLD家族的時空表達譜熱圖及激素誘導表達譜。

2 結果與分析

2.1 水稻PLD家族基因結構分析

經GSDS分析發現，水稻PLD家族成員基因長度在2982 bp(OsPLDα5)～11 305 bp(OsPLDζ1)范圍內(圖1)，絕大多數基因長度大于4 kb，只有OsPLDα3、OsPLDα5和OsPLDα8等少數基因長度少于4 kb，它們的長度分別為3671、3793和2982 bp(圖1)。不同亞類基因可能具有不同的外顯子數目，但同亞類基因的外顯子數大致一致；α型外顯子數目最少，OsPLDα1、OsPLDα2、OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5和OsPLDα8的外顯子數量均只有3個(圖1)，β型(OsPLDβ1和OsPLDβ2)與δ型(OsPLDδ1、OsPLDδ2和OsPLDδ3)的外顯子數目相當，均達到了10個，ζ型(OsPLDζ1)外顯子個數最多，達到了21個；而水稻中2個擬南芥不含有的φ和κ亞型成員(OsPLDφ和OsPLDκ)的外顯子數分別為7和6個。

2.2 水稻PLD家族蛋白基序分析

MEME在線分析蛋白序列基序特征發現，水稻PLD家族含有的氨基酸殘基數在511(OsPLDφ)～1164(OsPLDζ1)之間，大部分蛋白的基序集中分布在500～800位殘基區域；除OsPLDφ和OsPLDκ不含有共同基序外，其它成員要都含有2或3種共同基序，如，OsPLDζ1只含1、3基序而不包含基序2，而另14個成員都具有1、2和3基序。基序1、2、3具體對應的蛋白序列見圖2。

2.3 水稻PLD家族基因時空表達分析

通過提取水稻PLD家族基因的時空表達芯片數據發現，該基因家族在不同組織部位和不同發育時期呈現不同的表達特性，一般在根、莖、葉、花藥、子房等部位表達相對較高，在胚芽、胚乳等部位表達較低。在α亞型中，除OsPLDα7在胚乳發育晚期表達較高而在葉中表達較低外，其它7個成員的表達趨勢整體一致，都在莖、葉、根中的表達相對較高；成員OsPLDα4和OsPLDα6表現出較為相似的表達規律，在胚和胚乳中表達較低。在β亞類中，OsPLDβ1和OsPLDβ2的表達差異較大，OsPLDβ1在各部位中的表達水平普遍較低，而OsPLDβ2在各部位中的表達量要高于OsPLDβ1，特別是在子房和花藥中具有較高的表達量。對于δ型成員而言，其表達趨勢也不盡一致，OsPLDδ1在根中高表達，在胚乳和葉中表達較低；OsPLDδ2在花藥和子房中表達較高，在胚和胚乳表達較低；而OsPLDδ3在幼穗、子房和花藥等部位及胚胎整個發育階段的表達量較高，在胚乳和葉中表達相對較低；另外，OsPLDφ、OsPLDζ1和OsPLDκ這3個成員分別在胚、子房、莖中表達相對較高(圖3)。

圖1 水稻PLD家族基因結構分析Fig.1 Structural analysis of rice PLD-family genes

圖2 水稻PLD家族蛋白基序分析Fig.2 Protein motifs analysis of PLD-family in rice

2.4 水稻PLD家族激素誘導表達分析

誘導表達譜熱圖分析發現，水稻PLD家族在各種激素誘導下呈現出不同的表達響應模式，一般受JA(茉莉酸)和ABA(脫落酸)誘導后表達水平發生的變化較明顯，而對其它激素的敏感性相對較低。在Dα亞型中，OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5、OsPLDα8能夠受JA誘導表達上調，在處理1 h后加即有較高的表達量并能維持至12 h；在ABA處理下，整體表達量偏低，處理后期的表達量(如6～12 h)要低于前期(如1 h)；OsPLDα1、OsPLDα2和OsPLDα7對JA的敏感性要低于其它α亞型成員，OsPLDα1和OsPLDα2分別在ABA處理后的3～12 h和6～12 h進入高表達狀態。在β類型中，OsPLDβ1、OsPLDβ2都受ABA誘導而增強表達，其中OsPLDβ1在IAA(吲哚乙酸)處理3 h時表達量明顯上升，OsPLDβ2在JA處理1 h時表達量明顯上調，處理6～12 h后表達下降。在δ型成員中，OsPLDδ2在JA處理下的表達受明顯抑制，在BR(油菜素內酯)處理3 h時表達量較高，其它時間無明顯變化；OsPLDδ1和OsPLDδ3對各種激素的誘導似乎都不太敏感，OsPLDζ1在6～12 h、OsPLDζ3在12 h處受ABA微弱的誘導作用，但不明顯。對于OsPLDζ1而言，其表達受CTK(細胞分裂素)的微弱誘導，在其它激素處理下表達無明顯變化。另外，特有的φ型成員OsPLDφ在各種激素作用下表達無明顯變化，而κ亞型成員OsPLDκ在GA(赤霉素)和JA處理后都出現先升后降的趨勢。

Leaf Blade: 劍葉; Leaf Sheath: 葉鞘; Root: 根; Stem: 莖; Inflorescence: 花序; Anther: 花藥; Ovary: 子房; Embryo: 胚; Endosperm: 胚乳; Vegetative: 營養生長; Reproductive: 生殖; ripening: 成熟; DAF: Day after flowering, 開花后天數圖3 水稻PLD家族基因組織表達分析Fig.3 Expression analysis of PLD-family genes in rice tissue

ABA:脫落酸；GA:赤霉素；IAA:生長素；BR:油菜素內酯；CTK:細胞分裂素；JA:茉莉酸圖4 水稻PLD家族響應激素誘導表達分析Fig.4 Expression for rice PLD-family genes induced by hormone

3 討 論

目前，在擬南芥和番茄等植物中已鑒定了多個PLD家族成員[19-21]，發現PLD不僅能調控植物生長發育而且還能響應逆境脅迫[22-23]；但是，水稻中的相關報道較少。

生信分析是預測基因功能的基本研究手段。本研究發現，盡管水稻PLD家族的基因長度不論是在亞類間還是同一亞類中都存在著較大差異，但是同一亞型內的各成員基本上都具有一致的外顯子數目，比如α亞型多數成員都具有3個外顯子，而β亞型和δ亞型都含有10個外顯子(圖1)；這表明所屬同一亞型的各成員具有進化和功能上的保守性，而不同亞型間所呈現的外顯子數量多樣性暗示了它們可能在生長發育和逆境響應過程中發揮著不同的作用。經蛋白基序分析發現，該家族整體上具有較高的相似性，除擬南芥不含有而水稻所特有的兩種新型成員OsPLDφ、OsPLDκ型在基序方面各含有一段信號肽序列外，其余成員都具有2種或3種共同的結構域(圖2)，這表明大多數PLD可能具有相同的底物催化功能[20]，而OsPLDφ、OsPLDκ的蛋白產物在細胞內的作用部位可能區別于其它成員。

有研究指出，PLD可以在各個植物組織器官(種子、果實、根、莖、葉等)中廣泛表達，并且集中在生長代謝旺盛的部位，如成熟初期的種子和萌芽初期的幼苗[24-25]。本研究發現，水稻PLD的大部分成員在多數營養器官中都有較高的表達水平，而在生殖器官中的表達較低，只有OsPLDα7、OsPLDδ3和OsPLDδ1等少數基因在在生殖生長期的花序、胚或胚乳中較高表達；這說明PLD成員通過多樣化的時空表達行為影響不同組織器官中的脂質代謝及信號轉導途徑，進而調節水稻生長發育。

在激素誘導表達中，發現該家族成員能夠受不同激素影響表現出不同的應答方式，整體對ABA和JA的響應較為敏感，對BR和CTK無顯著變化。ABA是植物在逆境脅迫下誘導產生的激素分子，擬南芥AtPLDα1、AtPLDα3等都與ABA有緊密聯系，過表達AtPLDα1株系對ABA敏感性提高，而AtPLDα3突變株對ABA敏感性增加[7-8,11]，這說明PLD從不同方向響應逆境。水稻OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5和OsPLDα8等成員在ABA處理后有被抑制傾向，而OsPLDα1、OsPLDβ1、OsPLDζ1有增強表達趨勢，這可能與其基因啟動子區域存在ABA和逆境響應元件有關[25]。此外，水稻PLD基因對JA具有較強的反應，如OsPLDα3、OsPLDα4、OsPLDα5、OsPLDα8、OsPLDζ1和OsPLDκ等成員均受JA影響有一定的被誘導表達的傾向，而OsPLDα2、OsPLDβ2和OsPLDδ2等受JA影響有明顯的被抑制作用，故推測OsPLD成員很可能參與了JA介導的一些生物脅迫響應途徑，但有待進一步驗證。

本研究對水稻PLD家族進行了蛋白產物特征分析、組織時空以及響應激素的表達譜分析，這些信息將為深入研究基因家族的生物學功能提供依據。

4 結 論

水稻磷脂酶PLD家族族成員的基因長度和外顯子數呈現多樣化特點，所屬同一亞型的各成員擁有較一致的外顯子數目；大部分成員含有相同類型的基序，表明它們在功能上具有保守性和一致性。大多數水稻PLD成員在胚和胚乳中表達量低，而在各個植物組織器官(種子、果實、根、莖、葉等)中廣泛表達；它們受ABA和JA誘導表達，而對BR和CTK處理不敏感，各成員在不同激素處理后表現出不同的應答方式，暗示水稻PLD成員在逆境響應中執行不同的功能。本研究結果為深入認識水稻PLD家族的生物學功能提供了信息與參考。