基于UPLC-QTOF/MS的小麥發芽代謝組學分析方法

王麗娜 王步軍

研究簡報

基于UPLC-QTOF/MS的小麥發芽代謝組學分析方法

王麗娜 王步軍*

中國農業科學院作物科學研究所 / 農業農村部谷物品質監督檢驗測試中心, 北京 100081

為探究不同提取方法對發芽小麥代謝物提取效果的影響, 本研究建立了基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF/MS)的發芽小麥非靶向代謝組學樣品前處理方法和分析方法, 以發芽2 d周麥26籽粒為材料, 設計提取溶劑、提取方式、提取時間3個因素在3個水平上L9(34)正交試驗, 并通過主成分分析和聚類分析確定提取效果最佳的組合。以80%乙腈(0.1%甲酸)震搖提取30 min可檢測出1609個代謝峰, 說明提取溶劑對代謝物提取效果起主要作用。共鑒定出92種小麥代謝物。

代謝組學; 小麥; UPLC-QTOF/MS; 提取方法; 提取溶劑; 正交試驗

代謝組學通過大量代謝組分的定性、定量分析來研究生物體的代謝型與基因型的關系, 系統詮釋生物體的整體代謝情況[1-2], 是基因組學和蛋白質組學的延伸和發展。代謝組學主要分為靶向和非靶向2種, 靶向代謝組學即對目標代謝物進行監測, 而非靶向代謝組學是無偏向性分析方法, 試圖覆蓋盡可能多的代謝物。在代謝組學研究中, 樣品的制備是最容易引入系統誤差的一步[3], 但目前關于系統評估非靶向代謝組學樣品制備程序的研究較少, 已報道的研究主要集中在人血漿[4]、血清[5]、小鼠肝組織[6]、部分微生物[7]、植物[8-10]等方面。

樣品制備中的代謝物提取是至關重要的步驟, 在很大程度上影響代謝物提取的數量[11], 影響可檢測的代謝物范圍[12]。代謝物常用無機溶劑(水)和有機溶劑(甲醇[5]、乙腈[13-14]等)分別提取, 有機溶劑水溶液的代謝物提取率好于絕對有機溶劑[15]。包雨卓等[16]利用甲醇︰水= 3︰1 (v︰v)的水溶液提取冬小麥的代謝物, 分析其在不同溫度下的代謝差異; Yang等[17]利用0.3 mL甲醇和0.1 mL氯仿混合提取受鹽堿脅迫小麥中的代謝物; 張月等[18]在研究小麥粉中氯啶菌酯殘留實驗中用到的提取劑為乙腈︰水= 4︰1 (v︰v); Beccari等[19-20]在感染鐮刀菌枯萎病小麥產生次級代謝物的2篇研究中, 均用到乙腈︰水︰乙酸= 79︰20︰1 (v︰v︰v)的混合提取劑。

樣品制備過程復雜、繁瑣, 代謝物提取手段、提取時間及實驗者的實驗操作等因素同樣會影響樣品的制備水平[3,10]。胡賁等[21]優化了基于UHPLC-QTOF/MS的煙草代謝組學分析方法, 以影響提取效果的溶劑、提取方式、提取時間、提取溫度4個因素為研究對象, 確定甲醇(含0.1%甲酸)在4℃震搖提取20 min效果最好。Ruben等[12]在擬南芥代謝組學研究中, 比較了球磨機、研缽、高速分散機、超聲粉碎機、恒溫均質儀5種提取方法, 發現高速分散機能提取更多代謝物, 而研缽研磨具有最佳工藝效果。Kye等[22]認為提取溶劑特性、溶劑與樣品的比例、提取時間和溫度都會影響代謝物提取效果; 當提取效果不佳時, 可通過多次溶劑提取、增加提取時間并輔助提高溫度和超聲波處理來提高提取效率, 但Ruben等[12]認為反復溶劑提取對提取效果影響不大。甲酸的加入有利于提高代謝物的溶解度, 使提取更易進行[10]。

在本研究中, 采用超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜(UPLC-QTOF/MS)分析提取溶劑、提取方式、提取時間三種因素對發芽小麥代謝物提取效果的影響, 以代謝物檢出峰數目作為評定標準[5,12,21], 選擇適宜的提取方法, 旨在為小麥代謝組學研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為半冬性小麥周麥26。取大小均勻、籽粒飽滿的小麥種子, 以1%次氯酸鈉表面滅菌5 min, 放在培養皿濕濾紙上, 加入適量蒸餾水, 蓋上紗布, 放置在30℃、暗環境、47%濕度的恒溫恒濕培養箱發芽培養, 不同發芽階段(0、24、48和72 h)取樣, 樣品保存于–80℃冰箱, 待用。

1.2 正交試驗設計

選擇提取溶劑、提取方式、提取時間3個因素, 設計每個因素3個水平(表1)。因本研究為多因素多水平試驗, 全面試驗組合過多, 不易操作, 所以采用正交試驗設計方法, 從全部水平組合中挑選部分有代表的水平組合進行試驗, 通過這部分水平組合分析全面試驗的情況, 找出最優的水平組合[23]。參考L9(34)正交試驗表設計的處理組合, 詳見表2。

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗結果

1.3 樣品前處理

將發芽48 h的小麥樣品從–80℃取出后, 放入裝有液氮的保溫桶臨時保存, 在預冷的研缽內加入液氮研磨樣品成粉末。從每個處理取100 mg樣品置10 mL離心管內, 在不同處理組合下提取發芽小麥代謝物。在11,180′、4℃條件下離心10 min, 取上清液1 mL于進樣小瓶, 另取每個樣品100mL均勻混合成QC (混合質量控制組樣品, Quality Control)樣品, 待UPLC-QTOF/MS檢測。

1.4 色譜質譜分析條件

1.4.1 色譜條件 采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm′100.0 mm, 1.7mm); 流動相A為乙腈, 流動相B為水(含0.1%甲酸); UPLC梯度洗脫程序為2% A (0~1 min), 2%~40% A (1~5 min), 40%~70% A (5~12 min), 70%~95% A (12~15 min), 95% A (15~20 min); 流速為0.4 mL min–1; 樣品室溫度為10℃; 進樣量為1mL。

1.4.2 質譜條件 采用電噴離子源(electrospray ionization, ESI), MSE模式掃描, 亮氨酸腦啡肽作為校正液, 質量范圍50~1000 m/z, 毛細管電壓3.5 kV, 錐孔電壓40 V, 低能電壓4 V, 高能電壓20~40 V, 離子源溫度120℃, 脫溶劑溫度400℃, 掃描時間0.2 s。

1.5 數據處理

采用UNIFI軟件采集原始質譜圖, 將采集的原始數據導入Progenesis QI軟件進行峰提取、峰對齊、峰識別和歸一化等處理, 選擇QC-8樣品作為參照校正峰對數據進行標準化處理。依據代謝物分子量、保留時間[8,24]、碎片離子等信息與在線數據庫進行化合物的匹配鑒定, 篩選母體誤差0.005 Da, 碎片離子誤差10 mg L–1的化合物。采用Progenesis QI內部Ezinfo軟件對數據進行無監督的主成分分析(PCA), 從整體上分析不同處理組間差異。使用MeV 4.9.0軟件進行各代謝物平均豐度的聚類分析(HCA)。

2 結果與分析

2.1 小麥代謝物檢測分析

對QC樣品進行代謝物輪廓分析, ESI正離子模式下共提取出4113個峰, 借助Waters公司的CCS (碰撞截面積)數據庫進行代謝物信息比對, 在不同處理中鑒定了92種代謝物, 涵蓋糖類、有機酸、氨基酸、脂類和胺類等化合物。TIC (總離子流圖, total ion chromatogram)顯示QC樣品的峰形重現性良好, 表明系統較穩定(附圖1)。ESI負離子模式下代謝物響應較低, 化合物涵蓋范圍較小, 與已有報道情況相同[21,25], 故本研究不做討論。

2.2 正交試驗結果分析

由表2正交試驗結果極差分析可以看出, 影響發芽小麥代謝物提取峰數量的因素為A>B>C, 即提取溶劑>提取方式>提取時間。根據提取峰數量與圖1單因素對峰提取的影響可確認最佳的提取方法組合為A3B1C3, 即80%乙腈(0.1%甲酸), 振搖30 min提取發芽小麥代謝物。

2.3 多變量數據統計分析

PCA得分圖結果如圖2所示, 9個處理的3次重復在得分圖中分布較集中, 表明每個處理內差異較小, 本次實驗的穩定性比較好。根據每個處理在PCA圖里的分布特點, 可將9個處理分為X (處理1、處理2、處理3)、Y (處理4、處理5)、Z (處理6、處理7、處理8、處理9) 3組, 與提取溶劑因素分組相似, 說明小麥代謝物提取效果受提取溶劑的影響大于提取方式和提取時間, 結果與極差分析相符。X組為無機相提取劑, 在t[2]軸上與Y、Z組分離明顯; B、C組兼顧有機相和無機相提取劑, 在t[1]軸上分離明顯。PCA得分圖分析結合表2的不同處理正交試驗結果, 認為處理9在提取代謝物涵蓋范圍上優勢明顯, 是發芽小麥代謝物提取的最佳組合。

代謝物豐度聚類熱圖況反映代謝物的相對含量, 豐度越高, 代謝物相對含量越高(附圖2)。根據豐度差異, 可將代謝物分為6個簇(Cluster), 代謝物含量越低, 顏色越綠; 含量越高, 顏色越紅。簇1包含海藻糖、蜜二糖等5種糖類化合物; 簇2包含壬二酸、D-蘋果酸、二羥基富馬酸等13種有機酸; 簇3包含亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等16種氨基酸; 簇4包含甜菜堿、苯乙胺等7種胺類代謝物; 簇5包含肉豆蔻酸、棕櫚酸等38種脂類代謝物; 簇6包含腺嘌呤、乙偶姻、維生素B2、維生素C等13種其他代謝物。從熱圖分析可以看出, 簇2有機酸類代謝物在B、C處理組的檢出含量高于A處理組, 簇5脂類代謝物有相似的檢出特點, 表明B、C組的提取劑對這兩類代謝物有較好的覆蓋率; 簇1糖類代謝物在C處理組的檢出含量高于A、B兩組, 說明80%乙腈(0.1%甲酸)提取糖類代謝物效果更優。簇3、簇4、簇6部分代謝物的檢出情況與上述三簇相同。綜合上述情況, 認為處理組C在代謝物檢出豐度上更有優勢, 能覆蓋更多代謝物, 提取效果具有明顯優勢。

圖1 單因素對峰提取的影響

圖2 不同處理PCA分析

2.4 不同提取方法的代謝物檢出情況

已鑒定的代謝物檢出情況(附表1)表明代謝物對提取劑有一定的偏向性。保留時間長的代謝物親水性不強, A組提取劑僅為無機相純水(0.1%甲酸), 在保留時間長的大部分脂類等代謝物的檢出上表現較差, 水相制備的代謝物主要集中在早期保留時間和小m/z部分; B、C組有機無機混合提取劑不僅能涵蓋部分親水性代謝物, 還能檢出大部分親脂性代謝物, 彌補純無機相提取的不足。

3 討論

樣品的采集與制備不僅是代謝組學研究的第一步[26], 也是最容易引入系統誤差的一步[3], 樣品制備主要有樣品取樣、勻漿、提取和保存等步驟[27]。本研究采用正交試驗設計方法優化發芽小麥代謝物提取條件, 極差處理發現提取溶劑為影響小麥代謝物提取的主要因素, 這與已有的研究結果相似[21,24]。本研究的9個處理在PCA圖中的分布特點進一步驗證了這一結果, 同一提取溶劑的3個處理在PCA散點圖中分布較接近, 相似性更高[28], 表明提取溶劑對9個處理的分組趨勢影響更大, 提取方式與提取時間的影響較小。提取溶劑對代謝物的檢出有一定的偏向性, 水相提取的代謝物保留時間較短, 且偏向較小m/z, 而有機相提取的代謝物保留時間較長, 這與水稻[29]種子的代謝組學研究結果相同, 代謝物對有機相和無機相的偏好明顯。綜合幾類代謝物的檢出情況, 及優選與流動相相似的提取劑的原則[22], 本研究確定提取效果最佳的前處理為80%乙腈(0.1%甲酸)提取劑震搖提取30 min, 該條件下可檢出糖類、氨基酸、有機酸和脂類等小分子代謝物, 檢出更多代謝物峰, 且操作簡單、試劑經濟實惠, 可滿足發芽小麥代謝組學研究。

本研究選用甲醇和乙腈兩種常用提取劑為研究對象, 發現在基于UPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學研究中, 乙腈對發芽小麥代謝物的提取效率高于甲醇, 這一結果與已有研究不同。有報道指出植物中小分子代謝物的最佳提取劑為甲醇[30-31], 水與甲醇的組合適合多數非靶向研究[32-34], 當最佳提取劑未知時, Creydt等[10]建議優先選擇甲醇水溶液。Dopple等[35]利用LC-HRMS手段分析甲醇和乙腈及其水溶液對開花期小麥代謝物萃取情況, 發現甲醇和乙腈在提取率方面是互補的, 共檢測到996種代謝物, 鑒定代謝物109種。Han等[36]小麥胚和胚乳代謝研究中同樣用到100%甲醇為提取劑。在基于FIMS手段的草莓[37]代謝組學研究中也有相似報道, 甲醇∶水(v∶v = 50∶50, 0.1%甲酸)與100%乙腈可共同檢測到16%~36%的質量數, 但二者疊加可檢測多達5844個獨特12C。造成本研究與報道不同的原因可能是采用的檢測技術、樣品種類不同, 目前還沒有適用于所有植物代謝組學分析的方法, 本研究的結果可能并不適用于生長中的小麥, 在實際應用中應根據樣品種類、檢測儀器特性等因素確定代謝物的制取方法。

代謝組學是通過分析海量代謝物信息, 來探究生物體內源性代謝物整體及其變化規律的科學。海量信息的獲取不僅受提取方法的影響, 還受檢測儀器的分辨率等因素的影響。代謝組學常用高分辨檢測技術有GC-MS和LC-MS, 與LC-MS相比, GC-MS不易進行熱不穩定代謝物的分析, 且樣品前處理需衍生化, 不僅操作繁瑣、耗時, 還可能引入干擾物[38], 對組學分析產生誤差。LC-MS技術雖較晚應用到代謝組學中, 但具有檢測范圍廣, 適用于熱不穩定代謝物, 前處理簡單, 基本不需要衍生化等優點,成為本次研究的檢測技術。本研究采用的QTOF (飛行時間質譜)技術, 是目前使用較普遍的代謝組學質譜分析儀器, 質量準確度能達到1×10–6mg L–1 [39], 通過與超高壓液相色譜聯用, 掃描速度快, 為代謝物的定性分析提供更多依據。

數據庫作為代謝物定性鑒定的參考標準之一, 對后續代謝組學數據分析、深入探究生物學機理具有十分重要的作用。目前有許多可供使用的網絡開放數據庫, 如MassBank等, 但缺乏具有針對性的特定數據庫。因此, 建議未來可根據代謝物的分類建設不同類別數據庫, 將為代謝物篩選工作提供更多便利。

附圖和附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數據http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

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Analysis method of wheat germination metabolomics based on UPLC-QTOF/ MS

WANG Li-Na and WANG Bu-Jun*

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Cereal Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China

To investigate the effects of different extraction methods on the extraction of wheat metabolites in germination, we established a pre-treatment and analysis method for the metabolomics samples based on UPLC-QTOF/MS. In this study, we used Zhoumai 26 grains germinated for 2 days, and designed L9(34) orthogonal experiments with extraction solvents, extraction methods and extraction time three levels based on UPLC-QTOF/MS. Besides, the best combination of extraction was obtained by principal component and cluster analysis: 1609 metabolic peaks were detected by 80% acetonitrile (0.1% formic acid) with shocking for 30 min, indicating that the extraction solvent plays a major role in the extraction of metabolites. A total of 92 wheat metabolites were identified in this study.

metabolomics; wheat; UPLC-QTOF/MS; extraction method; extraction solvent; orthogonal experimental

本研究由國家糧油作物產品質量安全風險評估專項(GJFP2018001), 中國農業科學院科技創新工程項目和國家重點研發計劃項目(2016YFF0201803)資助。

This study was supported by the National Grain and Oil Crop Product Quality and Safety Risk Assessment Special (GJFP2018001), the Science and Technology Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences, and the National Key Research and Development Program (2016YFF0201803).

王步軍, E-mail: wangbujun@caas.cn

E-mail: hellowlina@sina.com

2019-02-25;

2019-06-24;

2019-07-19.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190719.1332.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.91017