藜麥GRF轉錄因子家族的鑒定及表達分析

時丕彪 何 冰 費月躍 王 軍 王偉義 魏福友 呂遠大 顧閩峰,*

藜麥GRF轉錄因子家族的鑒定及表達分析

時丕彪1何 冰2費月躍1王 軍1王偉義1魏福友1呂遠大2顧閩峰1,*

1鹽城市新洋農業試驗站, 江蘇鹽城 224049;2江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所, 江蘇南京 210014

生長調控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物特有的一類轉錄因子, 對植物的生長發育起重要的調控作用。藜麥是一種單體植物即可滿足人體基本營養需求的食物, 也是未來最具潛力的農作物之一。但是關于藜麥GRF基因家族的研究至今尚缺乏報道。因此, 本研究利用生物信息學方法, 對藜麥GRF基因進行全基因組鑒定, 并對其理化性質、基因結構、保守結構域、系統發育關系及組織表達進行分析。結果表明, 藜麥中共有18個GRF轉錄因子, 蛋白長度77~621 aa, 分子量8.81~67.38 kD, 等電點5.23~9.37; 每個成員含有1~4個內含子及2~5個外顯子, 這些GRF蛋白都具有由31~35個氨基酸組成的QLQ保守結構域或由25~43個氨基酸組成的WRC保守結構域。系統進化分析表明, 藜麥與擬南芥的GRF轉錄因子親緣關系比水稻更近。表達圖譜顯示, 藜麥GRF基因具有明顯的組織表達特異性, 總體在種子中的表達量較高, 其次是在花序和根中, 在其他組織中的表達量相對較低。

藜麥; GRF轉錄因子; 進化分析; 表達分析

轉錄因子是植物中最重要的一類調節基因, 參與植物生長、發育、代謝、繁殖、分化等多種生物學過程[1-3]。目前在植物中已發現60多個轉錄因子家族[4], 其中生長調控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物特有的一類蛋白, 對植物的生長發育起重要的調控作用[5-7]。GRF轉錄因子在N端區域含有QLQ和WRC兩個保守結構域[8-9], QLQ結構域與GRF互作因子GIF (GRF interacting factors)相互作用形成轉錄激活因子[10], WRC結構域包含一個功能核定位信號NLS (nuclear localization signal)區域和一個與DNA結合的鋅指基序[8], 均與GRF轉錄因子發揮生物學功能密切相關。

在水稻中首次發現了GRF基因, 該基因能夠調控赤霉素誘導的水稻莖的伸長[11]。近年來, 隨著基因組測序的完成, 越來越多物種中的GRF基因被鑒定和研究[12], 其中, 雙子葉模式植物擬南芥中共有9個GRF成員[8], 單子葉植物模式植物水稻中共有12個GRF成員[13]。相關研究表明, 這些GRF基因在生長發育活躍的組織中表達水平較高, 如莖尖、花芽、未成熟的葉片等, 但在成熟的組織或器官中表達量相對較低, 其中多種GRF基因參與了葉片原基細胞增殖的調控和莖尖分生組織器官的分離[14-19]。在擬南芥[20-21]和毛果楊[22]中發現GRF基因對花的發育起重要的調控作用; 有些GRF基因還參與擬南芥雌性生殖器官的發育和胚珠的形成[23],說明它們可能與種子的發育有關。在油菜中,基因能通過調控細胞數目和光合作用來增加油菜籽產油量[24]。

GRF蛋白主要是通過與GIF互作形成蛋白復合體參與這些生物學過程[25-28], 而GRF的功能有時又會受miR396的調控, 比如擬南芥中有7個基因是miR396的靶基因, 其表達受到miR396的調控, 進而對擬南芥根、莖、葉的生長發育產生影響[14]。GRF的表達量越高, 并不是越利于植物的生長發育, 如水稻過量表達引起植株多種生理缺陷, 包括葉片卷曲、開花延遲和心皮發育不完善[11]; 玉米過表達雖能增加葉片大小, 但降低了玉米可育性[29],過表達減小了葉片面積[30]; 擬南芥超表達植株的葉片生長受到明顯抑制[31]。

藜麥(Willd.)是一種全營養谷物, 富含人體必需的9種氨基酸[32], 被聯合國糧農組織(FAO)認定為一種單體植物即可滿足人體基本營養需求的食物[33], 并且藜麥對多種非生物脅迫如鹽堿、干旱、霜凍等具有一定的耐受性[34-36]。因此, 藜麥已引起了研究人員和消費者的廣泛關注。2017年公布了藜麥高質量參考基因組, 促進了藜麥功能基因組學的研究[37]。本研究利用生物信息學手段, 以擬南芥GRF基因家族成員的蛋白質序列為參考, 在藜麥基因組數據庫通過BlastP序列比對, 獲得藜麥GRF轉錄因子家族全部成員, 并對其理化性質、基因結構、保守結構域和系統發育關系以及根據RNA-seq數據對藜麥GRF基因在不同組織的表達模式進行分析, 旨在為進一步研究藜麥GRF轉錄因子的功能及GRF影響植物生長發育的調控機制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 基因組數據和轉錄組數據的來源

藜麥全基因組數據從Phytozome v12 (http:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/)中的v1.0獲得、轉錄組數據從NCBI獲得, 擬南芥GRF蛋白序列下載于擬南芥全基因組數據庫TAIR (https://www.arabidopsis.org/),水稻GRF蛋白序列下載于水稻全基因組數據庫(http://rapdb.dna.affrc. go.jp/)。

1.2 藜麥GRF基因家族成員的鑒定及分析

從擬南芥數據庫獲取基因家族成員的蛋白序列, 并以此為查詢對象在藜麥基因組數據庫進行Blastp比對, 設E值為10-5, 將得到的藜麥蛋白序列在Pfam (http://pfam.xfam.org/)和CDD (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)上檢測其結構域, 去除沒有QLQ或WRC結構域的蛋白序列。

將獲取的藜麥GRF基因的氨基酸序列輸入ExPasy網站(http://au.expasy.org/tool.html), 采用Compute pI/MW工具分析, 得到GRF蛋白的多種理化性質, 包括氨基酸長度、分子量、等電點等。

1.3 系統進化樹的構建

利用ClustalW對藜麥、擬南芥、水稻GRF的氨基酸序列進行多重比對, 使用MEGA 5.05軟件及鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)(bootstrap = 1000)構建無根進化樹。

1.4 藜麥GRF基因結構分析

根據藜麥GRF基因家族成員的基因組DNA序列及CDS序列, 利用GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku. edu.cn/)分析其基因結構。

1.5 藜麥GRF家族成員保守結構域分析

在Pfam分析得到藜麥GRF轉錄因子保守結構域的氨基酸序列起始位置, 利用IBS 1.0繪制結構域位置圖, 并利用ClustalX 2.0軟件對結構域氨基酸序列進行比對。

1.6 藜麥GRF基因的組織表達分析

從NCBI下載藜麥生長發育過程中各組織器官的RNA-Seq數據, 包括苗齡為6周的藜麥植株的根、莖、葉片、花序和幼苗以及0周齡的成熟干種子, 以此來分析藜麥GRF基因的表達情況。對各成員的表達量取log2TPM, 然后用R繪制藜麥GRF基因家族的組織表達熱圖。

1.7 基因的熒光定量表達分析

采用實時熒光定量PCR進一步確定從表達圖譜中篩選出來的組織表達特異性較為明顯的6個GRF基因的表達模式, 所取樣品與RNA-Seq所選樣品一致。使用TIANGEN試劑盒提取RNA, 用Takara的反轉錄試劑盒合成cDNA第1條鏈, 以各樣品的cDNA為模板, 濃度統一稀釋為100 ng μL-1, 進行定量PCR擴增,為內參基因[38], 各基因特異引物序列見表1。反應體系為20 μL, 包含10 μL SYBR green supermix、5.5 μL ddH2O、正反向引物各1 μL、2.5 μL cDNA。反應條件為95℃預變性10 min; 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 40個循環。采用2–ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 藜麥GRF基因家族成員的鑒定及分析

把擬南芥GRF蛋白序列在藜麥數據庫進行Blastp比對, 對所獲得的蛋白序列在Pfam數據庫進行結構域分析, 篩選出具有QLQ或WRC保守結構域的蛋白序列, 最終鑒定出18個藜麥GRF候選基因(表2)。

利用ExPasy對藜麥GRF基因的理化性質分析表明, 不同GRF轉錄因子的蛋白序列存在較大差異, 氨基酸長度77~621 aa, 蛋白分子量8.81~67.38 kDa, 其中均以AUR62007538最大, AUR62009885最小。等電點以AUR62013612最大, 為9.37, AUR62006018最小, 為5.23; 其中等電點小于7的GRF蛋白有6個, 偏酸性; 其余的12個GRF蛋白等電點均大于7, 偏堿性。

表1 定量PCR引物序列

表2 藜麥GRF基因家族成員基本信息

(續表2)

aa: 氨基酸; MW: 分子量; pI: 等電點。

aa: amino acid; MW: molecular weight; pI: isoelectric point.

2.2 藜麥GRF基因家族系統發育關系分析

為了更好地了解藜麥GRF基因家族的系統發育關系, 將藜麥(18個GRF基因)、擬南芥(9個GRF基因)和水稻(12個GRF基因)的GRF蛋白序列進行多重比對, 構建無根進化樹(圖1)。根據進化樹分支, 將39個GRF轉錄因子劃分為Class I、II、III、IV四類, 其中Class I和Class IV均有6個藜麥GRF基因, Class II有4個藜麥GRF基因, Class III存在2個藜麥GRF基因。Class III和Class IV只有藜麥和擬南芥GRF分布, 不存在水稻GRF基因, 并且在其他兩類中表現出擬南芥與藜麥GRF進化關系相對較近一些, 說明藜麥與擬南芥的GRF轉錄因子親緣關系比水稻更近。Class III只有3個基因、和, 說明這2個藜麥GRF基因與擬南芥具有較高的同源性, 在功能上可能也具有相似性。

圖1 藜麥、擬南芥和水稻GRF基因家族系統進化樹

2.3 藜麥GRF基因結構分析

如圖2所示, 不同GRF基因的結構存在一定的差異, 除、和具有2個外顯子和1個內含子外, 其他成員均含有2~4個內含子及3~5個外顯子; 根據目前藜麥基因組注釋檢測到, 6個GRF基因同時具有5￠-UTR(非翻譯區)和3￠-UTR, 4個GRF基因只含有3￠-UTR, 其余8個GRF基因沒有非翻譯區。

圖2 藜麥GRF基因家族進化樹與基因結構

18個GRF基因形成了8個旁系同源基因, 同源基因的結構具有一定的相似性(圖2)。如和為一對同源基因, 都含有3個外顯子和2個內含子, 基因長度也相似;和為一對同源基因, 均具有4個外顯子、3個內含子、5￠-UTR及3￠-UTR, 但第2個內含子長度差異較大。

2.4 藜麥GRF基因家族保守結構域分析

藜麥GRF轉錄因子蛋白序列在Pfam上分析結果顯示, 18個GRF蛋白均含有QLQ或WRC結構域, 并且兩結構域均位于蛋白的N端(圖3)。其中, AUR62009885、AUR62025191、AUR62028983和AUR62006018只具有QLQ結構域, AUR62035608、AUR62019933、AUR62004236和AUR62013612只具有WRC結構域, 其他10個GRF轉錄因子同時具有QLQ和WRC結構域。從圖3可以看出, 藜麥GRF同源基因對的蛋白長度及結構域位置有很高的相似性。

為了進一步分析藜麥GRF轉錄因子QLQ和WRC結構域的保守性, 對2個結構域的氨基酸序列進行多重比對, 發現QLQ結構域由31~35個氨基酸組成, WRC結構域由25~43個氨基酸組成, 并且兩結構域中均有多個氨基酸位點是保守不變的(圖4)。QLQ結構域的氨基酸序列為QX3LX2Q; WRC結構域含有一個跨越3個半胱氨酸C和1個組氨酸H的C3H模體, 其氨基酸序列為CX9CX10CX2H; 在藜麥中, WRC結構域的保守性比QLQ結構域更高一些。QLQ和WRC結構域中這些氨基酸保守區域可能通過與其他因子相互結合或相互作用, 從而影響藜麥GRF轉錄因子的激活與抑制。

2.5 藜麥GRF基因家族的組織表達分析

為初步分析藜麥GRF基因的功能, 利用RNA-Seq轉錄組數據對18個GRF基因在6個不同組織器官的表達情況進行分析, 包括6周齡的根、莖、葉片、花序和幼苗以及0周齡的成熟干種子。結果表明, 不同GRF基因在藜麥不同組織器官中的表達量存在明顯差異(圖5)。除在種子中不表達外, 其他GRF基因均在種子中有較高的表達量, 說明這些基因可能與藜麥種子的發育有重要關系; 各GRF基因在花序中均有表達, 表明它們可能在花序的發育過程中起著重要作用; 有9個GRF基因在根中不表達, 說明它們可能沒有參與藜麥根系的發育過程; 所有GRF基因在葉片中均不表達, 可能是因為GRF基因與藜麥葉片的發育關系不大; 除和外, 其他GRF基因均在莖中不表達, 說明這2個基因可能參與了藜麥莖的發育過程; 只有、、和在幼苗中有一定的表達量, 它們可能調控著藜麥幼苗的生長。綜上所述, 藜麥GRF基因具有明顯的組織表達特異性, 在種子中的表達量相對較高, 其次是花序和根, 在其他組織中的表達量相對較低, 揭示它們在藜麥不同組織中可能具有不同的生物學功能。

圖3 藜麥GRF蛋白保守結構域分析

圖4 藜麥GRF蛋白QLQ (A)和WRC (B)結構域的氨基酸序列比對

為了進一步確定GRF基因在藜麥不同組織器官中具有明顯的表達特異性, 從表達圖譜中挑選6個GRF基因并對其進行實時熒光定量PCR分析以確定其相應的表達模式。由圖6可知,在種子中的表達量顯著高于其他組織, 其次是花序, 在根、莖、葉和幼苗中幾乎不表達;和有著相同的組織表達模式, 在種子中的表達量相對較高, 其次是幼苗和花序, 在根、莖、葉中的表達量相對較低;和有著相似的組織表達模式, 在根中的表達量最高, 其次是幼苗, 在其他組織中表達量相對較低甚至不表達;在花序中的表達量最高, 其次是根和幼苗但表達量均相對較低, 在莖、葉和種子中幾乎不表達。定量PCR分析結果與上述表達圖譜結果基本一致。

圖5 GRF基因在藜麥不同組織中的表達模式分析

(圖6)

3 討論

隨著基因組測序技術的逐漸完善和分子生物學研究的不斷深入, 大量植物全基因組測序已經完成并陸續公布了其基因組數據庫, 這為鑒定植物基因家族、挖掘功能基因及研究基因功能等提供了極為有利的條件。GRF轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子, 在植物的生長發育過程中發揮著重要的調控作用。目前, GRF基因家族在擬南芥[8]、玉米[39]、水稻[13]、番茄[40]、大白菜[5]、大豆[41]等多種植物中已有研究。藜麥作為未來最具潛力的農作物之一, 富含極高的營養價值, 但關于其GRF基因家族的研究至今仍缺乏報道。關于模式植物擬南芥和水稻GRF基因功能的研究較為深入。基因通過調控葉綠體的分裂來增加葉片面積和葉綠素含量, 從而增強植物的光合作用以促進植物生長發育[42];是多種滲透脅迫響應基因的抑制因子, 通過與脫水反應元件結合蛋白的啟動子區域結合, 從而抑制該基因及其下游一系列滲透應激反應基因的表達, 可在正常生長條件下防止植物生長抑制[43]。過表達、、、的轉基因水稻植株均增強稻瘟病的抗性, 但各自生長變化不同,過表達導致植株生長缺陷, 而、、過表達則導致水稻產量性狀發生較好變化[44]。研究表明,能夠調控2種細胞分裂素脫氫酶前體基因和的表達, 導致細胞分裂素水平升高, 從而增加穗長度, 此外,過量表達可增加籽粒硬度[45],與、互作, 從而調控水稻籽粒大小[46], 對水稻高產育種和機械化收獲具有重要意義。

本研究利用生物信息學手段, 從藜麥全基因組數據庫中共鑒定出18個GRF基因家族成員, 比擬南芥(9個)和水稻(12個)成員數目更多, 這可能是由于異源四倍體植物藜麥在進化過程中發生了全基因組復制和串聯復制而導致GRF基因數目增加[47], 基因擴張同時也增強了藜麥對外界復雜多變環境的適應能力。藜麥GRF轉錄因子的蛋白長度、分子量、等電點等基本特性存在較大差異; 由于內含子的不斷插入使其基因結構也發生一定程度的變化, 每個成員含有1~4個內含子和2~5個外顯子, 部分GRF基因含有非翻譯區。氨基酸序列分析表明, 大部分成員同時具有QLQ和WRC兩個保守結構域, 少部分成員只具有其中一種結構域, 其中, QLQ結構域的基序為QX3LX2Q, WRC結構域的基序為CX9CX10CX2H, WRC結構域的保守性比QLQ結構域更高; QLQ和WRC結構域中這些氨基酸保守區域可能通過與其他因子相互結合或相互作用, 從而影響藜麥GRF蛋白的轉錄激活與抑制。對藜麥、擬南芥與水稻GRF基因家族構建系統進化樹, 可將其分為4個亞家族, 其中藜麥和擬南芥的GRF廣泛分布于每個亞家族, 水稻的GRF基因只存在于Class I和Class II, 表明GRF基因的進化在雙子葉植物和單子葉植物中存在差異, 藜麥與擬南芥GRF轉錄因子的親緣關系比水稻更為密切。

藜麥GRF基因主要在特定的組織和器官中表達, 可能在這些組織或器官的生長發育中發揮著重要的作用。本研究發現,、、、和在藜麥種子中的表達量均顯著高于其他檢測組織, 說明這些基因主要參與了藜麥種子的生長發育, 因此, 提高這些基因的表達水平可能有利于增加藜麥的產量。同源性越高的基因, 其功能越相似。例如,與擬南芥花的發育有關[48],和均與的同源性較高, 2個基因在藜麥花序中的表達量又相對較高, 說明和可能參與了藜麥花序的發育過程。水稻的基因與籽粒大小和籽粒硬度有關[45-46],其在藜麥中同源性較高的基因為和, 二者在種子中的表達量均顯著高于其他組織, 說明這2個基因可能與藜麥產量性狀有關。在后續的研究中還需要利用轉基因技術或基因沉默技術對這些基因的功能和作用機制進一步驗證。

4 結論

通過對藜麥GRF轉錄因子家族全基因組鑒定, 共獲得18個成員, 分屬4個不同亞家族, 具有典型的QLQ或WRC保守結構域, 基因表達具有明顯的組織表達特異性, 在種子和花序中表達量較高, 與藜麥籽實產量緊密相關。

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Identification and expression analysis of GRF transcription factor family of

SHI Pi-Biao1, HE Bing2, FEI Yue-Yue1, WANG Jun1, WANG Wei-Yi1, WEI Fu-You1, LYU Yuan-Da2, and GU Min-Feng1,*

1Xinyang Agricultural Experiment Station of Yancheng City, Yancheng 224049, Jiangsu, China;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China

Growth-regulating factors (GRFs) are plant-specific proteins which play an important role in regulating plant growth and development. Quinoa is one of the plant sources that can meet human daily nutritional needs and is also considered as one of the most promising crops in the future. However, no systematical study about GRF gene family has been performed in quinoa to date. In this study, the GRFs in the whole genome of quinoa were identified by bioinformatics method, and their physicochemical properties, gene structure, conserved domain, phylogenetic relationship and tissue expression were analyzed. There were 18 GRF transcription factors in quinoa, with the protein length from 77 to 621 aa, the molecular weight from 8.81 to 67.38 kD and the isoelectric point from 5.23 to 9.37. Each member contained 1–4 introns and 2–5 exons. And all 18 GRF proteins possessed highly conserved QLQ domain composed of 31–35 aa or WRC domain composed of 25–43 aa. Phylogenetic analysis showed that the GRF transcription factors were more closely related between quinoa andthan between quinoa and rice. The expression level of GRFs was higher in seed, moderate in inflorescence and root, and relatively lower in other tissues, showing obvious tissue expression specificity.

; GRF transcription factor; phylogenetic analysis; expression analysis

本研究由江蘇現代農業(蔬菜)產業技術體系(鹽城)推廣示范基地項目(JATS(2018)137)和江蘇省農業科學院探索性顛覆性創新計劃項目(ZX(17)2015)資助。

This study was supported by the Promotion Demonstration Base Program (Yancheng) of Jiangsu Modern Agriculture (Vegetable) Industry Technology System (JATS(2018)137) and Exploratory and Disruptive Innovation Program of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (ZX(17)2015).

顧閩峰, E-mail: ycgmf@126.com

E-mail: 1032175660@qq.com

2019-03-22;

2019-06-22;

2019-07-13.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190712.0844.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94049