普通小麥‘Holdfast’條銹病成株抗性QTL定位

楊芳萍 劉金棟 郭 瑩 賈奧琳 聞偉鄂 巢凱翔 伍 玲 岳維云 董亞超 夏先春,*

普通小麥‘Holdfast’條銹病成株抗性QTL定位

楊芳萍1,2,**劉金棟2,3,**郭 瑩1賈奧琳2聞偉鄂2巢凱翔4伍 玲5岳維云6董亞超2夏先春2,*

1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所, 甘肅蘭州 730070;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 國(guó)家小麥改良中心, 北京 100081;3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所, 廣東深圳 518120;4西北農(nóng)林大學(xué)植保學(xué)院, 陜西楊凌 712100;5四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 四川成都 610066;6天水農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 甘肅天水 741200

Holdfast是來(lái)自英國(guó)的小麥品種, 多年來(lái)一直保持良好的條銹病持久抗性。本研究目的是發(fā)掘Holdfast的條銹病成株抗性基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記, 為小麥持久抗性品種選育提供材料和方法。利用銘賢169和Holdfast雜交后代重組自交系(recombinant inbred lines, RIL)群體, 于2014—2015和2015—2016年度在甘肅甘谷、甘肅中梁和四川成都進(jìn)行條銹病成株抗性鑒定, 并統(tǒng)計(jì)最大嚴(yán)重度(maximum disease severity, MDS)。基于小麥660K SNP芯片和BSA (bulked segregant analysis)技術(shù)初步確定抗病基因所在的染色體后, 將目標(biāo)區(qū)域的SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為KASP (Kompetitive allele specific PCR)標(biāo)記, 檢測(cè)整個(gè)RIL群體, 進(jìn)行基因型分析。最后進(jìn)行RIL群體條銹病成株抗性的QTL分析, 在5AL和7AL染色體上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)成株抗性QTL。5A染色體長(zhǎng)臂上1個(gè)條銹病成株抗性QTL, 在所有環(huán)境下均存在, 可解釋6.5%~9.3%的表型變異;位于標(biāo)記和之間, 連鎖距離分別為0.5 cM和1.1 cM。在7A染色體長(zhǎng)臂上定位到1個(gè)條銹病成株抗性QTL, 在2015年和2016年甘谷環(huán)境中均穩(wěn)定存在, 分別解釋6.2%和7.3%的表型變異;位于標(biāo)記和之間, 連鎖距離分別為0.5 cM和0.7 cM。攜帶和抗病等位基因家系的MDS顯著低于感病等位基因家系的MDS, 表明和可有效降低條銹病嚴(yán)重度, 可應(yīng)用于小麥抗條銹育種。

普通小麥; 條銹病; 成株抗性; SNP標(biāo)記; 連鎖分析

由小麥條銹菌(f. sp.)引起的小麥條銹病是世界范圍內(nèi)的重要病害, 可導(dǎo)致減產(chǎn)5%~25%[1], 嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)。雖然條銹病可通過(guò)化學(xué)藥劑等措施防治, 但利用寄主抗性, 培育和推廣抗病品種是防治小麥條銹病最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的途徑。

小麥對(duì)條銹病的抗性可分為苗期抗性和成株抗性。苗期抗性一般由單個(gè)或少數(shù)主效基因控制, 又稱主效基因抗性、全生育期抗性或垂直抗性, 對(duì)條銹菌生理小種的抗性有高度特異性, 往往呈高抗或免疫。苗期抗性對(duì)病原菌有較強(qiáng)的選擇壓力, 過(guò)度應(yīng)用會(huì)引起生理小種變異, 使品種喪失抗性。成株抗性由多個(gè)微效基因控制, 又稱部分抗性、水平抗性或慢病性。成株抗性品種往往苗期表現(xiàn)感病, 而成株期表現(xiàn)中抗或高抗, 對(duì)病原菌無(wú)小種專化性或?qū)；匀酢３芍昕剐詫?duì)病原菌選擇壓力較小, 大面積種植可有效減緩生理小種變異, 使抗性持久穩(wěn)定。長(zhǎng)期以來(lái), 大多數(shù)小麥育種家利用苗期抗性培育高抗至免疫的品種, 導(dǎo)致品種抗性頻繁喪失, 使抗條銹病育種工作長(zhǎng)期處于被動(dòng)狀態(tài)。前人研究表明, 成株抗性基因聚合是選育兼抗多種病害品種的重要方式, 聚合4~5個(gè)成株抗性基因(如、等)可將條銹抗性提升至高抗至近免疫水平, 且抗性持久穩(wěn)定[2]。

發(fā)掘成株抗性基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記是有效利用成株抗性、培育持久抗性品種的重要手段[2-7]。近年來(lái), 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 小麥條銹病抗性基因發(fā)掘研究取得較大進(jìn)展。迄今為止, 國(guó)際上正式命名的小麥條銹病抗性基因已有80個(gè)(~)[8-9]。在已正式命名的基因中, 55個(gè)為苗期抗病基因(、等), 其余25個(gè)為成株抗性基因(如等),其中、、、和為高溫成株抗性基因。除此之外, 還有40多個(gè)暫時(shí)命名的條銹病抗性基因。目前,、、、、和等[10-13]已被克隆。

近年來(lái), 由于條銹菌生理小種的快速變異, 已定位的苗期抗性基因大多已喪失抗性, 給小麥生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重威脅。因此, 發(fā)掘成株抗性基因, 培育持久抗性小麥品種, 對(duì)于保證我國(guó)糧食安全具有重要意義。基于雙親群體的連鎖分析是發(fā)掘數(shù)量性狀位點(diǎn)的有效方法[14]。SNP標(biāo)記在基因組中廣泛存在, 具有標(biāo)記密度高、覆蓋范圍廣且可高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, SNP標(biāo)記已逐漸應(yīng)用于高密度遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀基因定位研究, 有效提升QTL的檢測(cè)效率和精度。迄今為止, 國(guó)內(nèi)外已定位了150余個(gè)條銹病成株抗性QTL, 在小麥21條染色體上均有分布。

Holdfast是來(lái)自英國(guó)的小麥品種, 農(nóng)藝性狀優(yōu)良, 引進(jìn)國(guó)內(nèi)后一直保持良好的條銹病成株抗性, 迄今仍是我國(guó)甘肅重要的抗病親本。前人研究表明, Holdfast不僅攜帶苗期抗病基因, 同時(shí)還攜帶成株抗性基因[15-16]。先前針對(duì)Holdfast的研究主要集中于不同生理小種的表型鑒定和初步遺傳學(xué)分析, 其攜帶的成株抗性基因仍不明確[15-17]。因此, 本研究基于SNP標(biāo)記, 對(duì)Holdfast進(jìn)行成株抗性QTL定位, 以明確其抗性遺傳機(jī)制, 為小麥條銹病持久抗性育種提供材料和分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以感病品種銘賢169為母本, 抗銹品種Holdfast為父本, 采用單粒傳法構(gòu)建含有288個(gè)株系的F6代重組自交系(recombinant inbred lines, RIL)群體。2014—2015和2015—2016年度于甘肅中梁、甘肅甘谷和四川成都種植該群體及其親本, 以鑒定條銹病成株抗性。田間試驗(yàn)采用單行區(qū)、隨機(jī)區(qū)組排列, 行長(zhǎng)1.5 m, 行距25 cm, 3次重復(fù)。在試驗(yàn)區(qū)垂直方向種植條銹病誘發(fā)行。甘肅甘谷和中梁誘發(fā)行品種為銘賢169和輝縣紅, 四川成都點(diǎn)誘發(fā)行品種為川育12和SY95-71。

1.2 條銹菌接種

為促進(jìn)條銹發(fā)病, 在甘肅甘谷和中梁, 于小麥三至四葉期利用包含CYR32、CYR33、CYR34、水4、水7、Hybrid46-8和G22-14的混合菌種對(duì)誘發(fā)行人工噴霧接種(孢子懸浮液, 0.03%吐溫20), 接種后用塑料薄膜覆蓋保濕24 h。甘肅甘谷和中梁點(diǎn)條銹病混合菌種由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。在四川成都, 利用CYR32、CYR33、Hybrid46-8、G22-12等混合小種對(duì)銘賢169幼苗人工接種。隨后于植株三至四葉期, 在誘發(fā)行中移栽接菌發(fā)病的銘賢169幼苗。四川成都點(diǎn)菌種由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.3 條銹病抗性鑒定

參照改良的Cobb方法[18]鑒定條銹病抗性。目測(cè)植株旗葉和倒二葉條銹菌孢子堆面積占葉片面積的百分比, 即病害嚴(yán)重度(disease severity)。感病親本銘賢169在成株期的條銹病嚴(yán)重度達(dá)80%~100%時(shí), 分2次記載嚴(yán)重度, 并用2次調(diào)查的最大嚴(yán)重度(maximum disease severity, MDS)作為最終表型數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。根據(jù)發(fā)病時(shí)間的不同, 分別于4月上中旬(四川成都)、5月中下旬(甘肅甘谷)、5月底(甘肅中梁)進(jìn)行條銹病MDS記載。

1.4 表型數(shù)據(jù)和等位基因效應(yīng)分析

利用Microsoft Excel 2016對(duì)銘賢169/Holdfast RIL群體不同試驗(yàn)點(diǎn)小麥條銹病MDS進(jìn)行頻率分析和每個(gè)QTL等位基因效應(yīng)的測(cè)驗(yàn); 利用SAS 9.3 (http://www.sas.com/) PROC GLM程序進(jìn)行方差分析(analysis of variance, ANOVA)。

1.5 基因型分析

采用集群分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)分別選擇20株高抗家系(MDS<25%)和20株高感家系(MDS>80%)構(gòu)建兩組抗感池。利用小麥660K iSelect SNP芯片(633,562個(gè)SNP位點(diǎn))[20]對(duì)構(gòu)建的2組抗感池和親本進(jìn)行掃描(北京博奧生物技術(shù)有限公司, http://www.capitalbiotech.com/)。使用Affymetrix公司的GTC軟件(http://www.affymetrix. com/estore/)進(jìn)行SNP分型和聚類分析。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性, 剔除無(wú)多態(tài)性及低質(zhì)量的SNP標(biāo)記(缺失率>20%)。

基于SNP分型數(shù)據(jù), 確定銘賢169/Holdfast RIL群體抗感池間差異SNP主要集中區(qū)域。根據(jù)差異SNP及其所在的染色體物理位置, 利用在線平臺(tái)Poly Marker網(wǎng)站(http://polymarker.tgac.ac.uk/)設(shè)計(jì)KASP特異引物。隨后, 在2條正向KASP引物5￠端添加FAM或者HEX熒光接頭序列, FAM接頭序列為5￠-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3￠, HEX接頭序列為5￠-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3￠。所有引物均由華大生物技術(shù)有限公司合成(北京, http://www.genomics.cn/)。將合成后的引物配置成引物Mix (2條正向引物為12 mmol L–1, 反向引物為30 mmol L–1), 并用親本和抗感池驗(yàn)證標(biāo)記的多態(tài)性,然后進(jìn)行遺傳群體的基因型分析。

KASP檢測(cè)基于LGC Genomics公司(https://www. lgcgroup.com/cn)提供的方法。反應(yīng)體系為2.5 μL 2×KASP V4.0 Mastermix, 0.056 μL引物mix, 20~50 ng μL–1的DNA模板1 μL, ddH2O補(bǔ)足至5 μL。PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min; 94℃變性20 s, 65℃退火20 s, 每循環(huán)一次降1℃, 9個(gè)循環(huán); 95℃變性10 s, 59℃退火60 s, 35個(gè)循環(huán), 于4~10℃環(huán)境下保存產(chǎn)物。PCR完成后放在酶標(biāo)儀中讀取終端熒光數(shù)據(jù), 隨后導(dǎo)入Kluster Caller軟件進(jìn)行基因分型。

1.6 遺傳連鎖圖譜及QTL分析

采用JoinMap v4.0, 基于Kosambi函數(shù)(Kosambi, 1943)計(jì)算遺傳距離, 構(gòu)建連鎖圖。基于遺傳圖譜, 利用QTL Cartographer v2.5 (http:// statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.ht)的復(fù)合區(qū)間作圖法(composite interval method, CIM)對(duì)不同環(huán)境下條銹病抗性及其均值進(jìn)行QTL分析。若單個(gè)QTL可在2個(gè)及以上的環(huán)境下重復(fù)檢測(cè)到, 則認(rèn)為該QTL穩(wěn)定存在[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 銘賢169/Holdfast RIL群體條銹病MDS表型分析

成株抗性品種Holdfast在成都2015、甘谷2015、中梁2015、成都2016和甘谷2016五個(gè)環(huán)境下平均MDS分別為2.0%、20.1%、19.8%、20.0%和17.0%, 銘賢169在5個(gè)環(huán)境下平均MDS分別為50.8%、73.3%、69.0%、78.3%和65.3%。銘賢169/Holdfast RIL群體在5個(gè)環(huán)境下平均MDS值分別為46.7%、70.1%、73.7%、72.9%和67.6%, 變異范圍分別為0~90.0%、20.0%~100.0%、10.5%~100.0%、20.0%~ 100.0%和15.0%~90.0%。RIL家系MDS值在多數(shù)環(huán)境間相關(guān)系數(shù)達(dá)顯著或極顯著水平(表1), 表型數(shù)據(jù)相對(duì)穩(wěn)定。

銘賢169/Holdfast RIL群體的MDS值在5個(gè)環(huán)境下均呈現(xiàn)連續(xù)性變異, 表明該群體條銹病成株抗性為典型的數(shù)量性狀遺傳(圖1)。此外, 方差分析表明, 該群體后代MDS在不同環(huán)境、不同株系、環(huán)境內(nèi)不同重復(fù)以及基因型與環(huán)境互作間差異均達(dá)到極顯著水平(< 0.001)(表2), 其MDS的廣義遺傳力為0.65。以上結(jié)果表明抗病基因和環(huán)境共同影響條銹病成株抗性。

**顯著性水平(< 0.01);*顯著性水平(< 0.05)。**Significance at< 0.01;*Significance at< 0.05.

a: 中梁2015; b: 成都2015; c: 甘谷2015; d: 成都2016; e: 甘谷2016; f: 總平均。

a: Zhongliang 2015; b: Chengdu 2015; c: Gangu 2015; d: Chengdu 2016; e: Gangu 2016; f: mean MDS across five environments.

表2 銘賢169/Holdfast RIL群體小麥條銹病MDS方差分析

**代表0.01顯著水平。**Significance at< 0.01.

2.2 銘賢169/Holdfast RIL群體抗感池及其親本SNP芯片分析

利用小麥660K SNP芯片對(duì)基于條銹病抗性構(gòu)建的2組抗感池和雙親進(jìn)行掃描。參照660K芯片SNP公共遺傳圖譜[19], 共計(jì)1748個(gè)具有染色體位置信息的多態(tài)性SNP位點(diǎn)在抗感池和親本間均存在差異。在小麥21條染色體中, 7A染色體上的多態(tài)性位點(diǎn)最多且分布集中(421.1~439.8 Mb區(qū)段), 其次為5B和5A染色體(圖2)。

圖2 銘賢169/Holdfast RIL群體中多態(tài)性SNP在基因組中的分布

2.3 基因型信息分析

參照小麥IWGSC v1.0參考基因組(https://urgi. versailles.inra.fr/jbrowseiwgsc/gmod_jbrowse/?data=my Data% 2FIWGSC_RefSeq_v1.0), 利用本地Blast獲取差異SNP側(cè)翼序列。基于差異SNP側(cè)翼序列, 在Poly Marker網(wǎng)站設(shè)計(jì)特異性引物。選擇位于4B、5B、5A、6A和7B染色體上的96對(duì)KASP引物, 利用抗、感池和親本對(duì)96對(duì)引物進(jìn)行篩選。用篩選后的多態(tài)性引物對(duì)銘賢169/Holdfast RIL群體目標(biāo)區(qū)段進(jìn)行掃描, 最終在5A染色體上有3個(gè)可用標(biāo)記(、和), 7A染色體上有15個(gè)可用標(biāo)記(、、、、、、、、、、、、、和)。在5B染色體上開發(fā)了21個(gè)KASP標(biāo)記, 但通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)抗感株系檢測(cè)時(shí), 多態(tài)性標(biāo)記分散, 無(wú)法構(gòu)建完整的連鎖圖, 在5B染色體上未檢測(cè)到QTL。

2.4 遺傳連鎖圖譜和成株抗性QTL分析

結(jié)合基因型數(shù)據(jù)和條銹病MDS表型數(shù)據(jù), 對(duì)銘賢169/Holdfast RIL群體進(jìn)行條銹病成株抗性基因定位。結(jié)果在5A染色體長(zhǎng)臂上定位到1個(gè)條銹病成株抗性位點(diǎn), 與KASP標(biāo)記和緊密連鎖, 距離分別為0.5 cM和1.1 cM, 命名為, 在中梁2015、成都2015、成都2016、甘谷2015年和甘谷2016以及均值環(huán)境下均存在, 可解釋6.5%~9.3%的表型變異。在7A染色體長(zhǎng)臂上定位到1個(gè)穩(wěn)定的條銹病成株抗性QTL, 命名為, 在甘谷2015和甘谷2016兩個(gè)環(huán)境中存在, 分別解釋6.2%和7.3%的表型變異, 兩側(cè)標(biāo)記分別為(0.5 cM)和(0.7 cM)。

圖3 銘賢169/Holdfast RIL 群體條銹病成株抗性QTL (5AL和7AL)的LOD值曲線圖

對(duì)含有和抗病等位基因和感病等位基因的家系分析發(fā)現(xiàn), 含有抗病等位基因家系的MDS要顯著低于含有感病等位基因家系的MDS值(圖4, 附表1)。

圖4 銘賢169/HoldfastRIL群體中Qyr.gaas-5AL和Qyr.gaas-7AL對(duì)條銹病抗性的等位基因效應(yīng)

*顯著性水平(<0.05)。*Significant at<0.05.

3 討論

近年來(lái), 我國(guó)小麥條銹菌生理小種變異加速, 多個(gè)具有較大推廣面積、攜帶苗期抗性基因的品種喪失抗性, 嚴(yán)重威脅我國(guó)小麥生產(chǎn)安全。尋找新的抗病資源, 發(fā)掘抗性基因及其緊密連鎖標(biāo)記, 對(duì)于解析條銹病抗性遺傳機(jī)制, 加快抗病育種進(jìn)程具有重要作用。甘肅隴南地區(qū)是小麥條銹菌最大的越夏區(qū)和新小種發(fā)源地, 為小麥主產(chǎn)區(qū)條銹病的發(fā)生提供大量的菌源[20-21]。因此, 甘肅隴南地區(qū)是我國(guó)小麥條銹病防治的關(guān)鍵地帶。發(fā)掘新的抗病基因, 培育適宜于甘肅隴南地區(qū)種植的抗病品種是防治我國(guó)小麥條銹病的重要措施[22]。成株抗性小麥品種成株期病害嚴(yán)重度低, 田間病情動(dòng)態(tài)消長(zhǎng)慢, 病斑面積小, 潛育期長(zhǎng), 對(duì)產(chǎn)量的影響較小, 且抗性可維持時(shí)間較長(zhǎng)。當(dāng)前, 國(guó)際上多數(shù)國(guó)家和地區(qū)已將成株抗性的利用作為小麥抗病育種的主攻方向[23-26]。20世紀(jì)60年代至今, 國(guó)際玉米小麥改良中心(International Maize and Wheat Improvement Center, CIMMYT)選育出一大批成株抗性品種, 如Parula、Trap、Jupateco 73R、Pavon 76、Attila等, 均攜帶或及其他2~3個(gè)微效基因[27-28]。美國(guó)、澳大利亞和歐洲也對(duì)條銹病成株抗性進(jìn)行了深入研究, 并成功用于生產(chǎn)實(shí)踐。近年來(lái), 我國(guó)在成株抗性研究和應(yīng)用方面也取得了快速進(jìn)展, 對(duì)部分優(yōu)良成株抗性品種(如咸農(nóng)4號(hào)、平原50、Libellula、魯麥21、百農(nóng)64等)進(jìn)行遺傳分析, 并利用分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular marker assisted selection, MAS)培育出一批優(yōu)良的成株抗性品系[29-30]。Holdfast在甘肅隴南地區(qū)長(zhǎng)期種植, 攜帶多個(gè)抗性基因, 在小麥成株抗性育種中被廣泛應(yīng)用[15-17]。中梁30是由天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所以Holdfast為母本選育而成的冬小麥新品種, 農(nóng)藝性狀優(yōu)良, 對(duì)小麥條銹病具有持久抗性[31]。發(fā)掘Holdfast中的條銹病成株抗性基因, 對(duì)于培育適宜于甘肅隴南地區(qū)種植的持久抗性品種具有重要意義。

前人研究報(bào)道, Holdfast不僅攜帶苗期抗性基因, 還同時(shí)攜帶成株抗性基因[15-16]; 但關(guān)于Holdfast的抗病基因研究主要集中于表型鑒定和初步遺傳學(xué)分析, 其攜帶的成株抗病基因未見定位報(bào)道[15-17]。本研究基于BSA方法, 利用660KSNP芯片, 在銘賢169/Holdfast RIL群體中快速定位到2個(gè)條銹病成株抗性QTL:和, 在多個(gè)環(huán)境下穩(wěn)定存在, 分別解釋6.5%~9.3%和6.2%~7.3%的表型變異。

3.1 QYr.gaas-5AL

小麥5AL染色體上存在多個(gè)成株抗性基因, 如[32]、[33]、[34]、[26]和[3]。其中,的供體親本是Wawht2046, 連鎖標(biāo)記為。來(lái)自于PI610750, 與春化基因共分離, 定位于5A長(zhǎng)臂的端粒附近, 兩側(cè)標(biāo)記為和遺傳距離分別為4.4 cM和0.3 cM。對(duì)平原50/銘賢169 DH群體進(jìn)行條銹病成株抗性定位, 在5AL染色體上檢測(cè)到1個(gè)抗性位點(diǎn), 標(biāo)記區(qū)間為–, 可解釋5.0%~19.9%的表型變異;的供體親本為Opata 85, 與和緊密連鎖, 距離遠(yuǎn)端26 cM處, 可解釋15.0%的表型變異[27,34];供體親本為Pau 14087, 在遠(yuǎn)端68.7 cM處, 標(biāo)記區(qū)間為-[3,34]。基于IWGSC物理圖譜及Maccaferri等[36]構(gòu)建的整合遺傳圖譜,與以上QTL均不同, 該位點(diǎn)有可能是一個(gè)新的條銹病抗性QTL。

3.2 QYr.gaas-7AL

小麥7AL染色體上也存在多個(gè)條銹病抗性位點(diǎn)。來(lái)自于法國(guó)品種Recital, 位于7AL染色體上, 連鎖標(biāo)記區(qū)間為b–[37]; Zwart等[38]在小麥品種CPI133872檢測(cè)到一個(gè)條銹病抗性QTL, 位于–區(qū)間;是來(lái)自Avocet感病植株的一個(gè)效應(yīng)微小的QTL, 兩側(cè)標(biāo)記為和1[39];與位于同一遺傳區(qū)域(726.5 Mb處), 與緊密連鎖, 而的遺傳標(biāo)記為[40]。基于IWGSC小麥物理圖譜及Maccaferri等[36]構(gòu)建的整合遺傳圖譜,與以上位點(diǎn)位置不同, 可能是一個(gè)新的條銹病抗性QTL。

前人研究表明, 聚合4~5個(gè)條銹病成株抗性QTL的小麥品種在田間表現(xiàn)高水平抗性[2,29,41], 是實(shí)現(xiàn)品種持久抗性的重要方法。在本研究中,和均表現(xiàn)出穩(wěn)定的條銹病成株抗性。和及其緊密連鎖的KASP標(biāo)記, 可以用于分子標(biāo)記輔助選擇, 進(jìn)行小麥條銹病成株抗性QTL聚合育種。

3.3 KASP分型的優(yōu)勢(shì)

近年來(lái), KASP技術(shù)發(fā)展迅速, 廣泛應(yīng)用于QTL精細(xì)定位、種子質(zhì)量檢測(cè)、分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì)資源鑒定工作, 可快速準(zhǔn)確確定品種的基因型。KASP平臺(tái)是基于PCR的高通量SNP分型檢測(cè)技術(shù), 通過(guò)引物末端堿基特異性匹配來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中, 樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后可立即放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè), 大大縮短了操作時(shí)間。與SSR標(biāo)記相比, 每人每天至少可完成384×20個(gè)樣品的KASP標(biāo)記檢測(cè), 是SSR標(biāo)記分析的20倍, 大大提高了工作效率[42]。本研究結(jié)合基因芯片和KASP平臺(tái), 利用BSA方法, 在短時(shí)間內(nèi)完成了銘賢169/Holdfast RIL群體條銹病成株抗性QTL定位工作。KASP平臺(tái)可有效提升數(shù)量性狀基因發(fā)掘效率, 大幅促進(jìn)小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種進(jìn)程。

4 結(jié)論

利用銘賢169/Holdfast RIL群體, 在多個(gè)環(huán)境下對(duì)條銹病MDS進(jìn)行鑒定, 結(jié)合660K SNP芯片和BSA快速基因定位技術(shù), 在5A和7A染色體上檢測(cè)到2個(gè)條銹病成株抗性位點(diǎn)和, 分別解釋6.5%~9.3%和6.2%~7.3%的表型變異。RIL群體中攜帶和優(yōu)異抗病等位基因家系的MDS顯著低于感病等位基因家系。

附表 請(qǐng)見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬(wàn)方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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QTL mapping of adult-plant resistance to stripe rust in wheat variety holdfast

YANG Fang-Ping1,2,**, LIU Jin-Dong2,3,**, GUO Ying1, JIA Ao-Lin2, WEN Wei-E2, CHAO Kai-Xiang4, WU Ling5, YUE Wei-Yun6, DONG Ya-Chao2, and XIA Xian-Chun2,*

1Wheat Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, Gansu, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Wheat Improvement Center, Beijing 100081, China;3Institute of Shenzhen Agricultural Genome, Chinese Aca-demy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong, China;4College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China;5Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, Sichuan, China;6Tianshui Institute of Agricultural Sciences, Tianshui 741200, Gansu, China

Holdfast is an elite wheat cultivar from the United Kingdom with well durable resistance to stripe rust for many years. The aim of the present study was to identify adult-plant resistance (APR) genes to stripe rust in Holdfast and closely linked molecular markers to provide materials and methods for breeding wheat cultivars with durable resistance. A recombinant inbred lines (RIL) population, generated from the cross between Mingxian 169 (highly susceptible) and Holdfast, was planted in Zhongliang and Gangu of Gansu province, and Chengdu of Sichuan province during 2014?2015 and 2015?2016 cropping seasons for evaluating maximum disease severities (MDS) of stripe rust. The chromosomal locations of QTL were firstly determined based on the wheat 660K SNP array and bulked segregant analysis. Then kompetitive allele specific PCR (KASP) markers were developed to genotype the entire RIL population. Finally, the quantitative trait loci (QTLs) mapping of adult-plant resistance to stripe rust in the RIL population were performed, and two QTLs for APR to stripe rust were mapped on chromosomes 5AL and 7AL, respectively. The QTL on chromosome 5AL, designated, was identified in all environments, including Zhongliang 2015, Chengdu 2015, Chengdu 2016, Gangu 2015, Gangu 2016, explaining phenotypic variances ranging from 6.5% to 9.3%.was flanked by markersandwith genetic distances of 0.5 cM and 1.1 cM, respectively. The 7AL QTL, designated, was detected in two environments Gangu 2015 and Gangu 2016, explaining 6.2% and 7.3% of the phenotypic variances, respectively.was mapped between markersandwith genetic distances of 0.5 cM and 0.7 cM, respectively. The RILs containing the resistance allele atandloci were more resistant to stripe rust and had significantly lower MDS than those without the resistance alleles ofand, indicating thatandcan effectively reduce stripe rust severities, thus may be used in wheat breeding for improvement of stripe rust resistance.

common wheat; stripe rust; adult-plant resistance; SNP markers; linkage analysis

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360336), 蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2019-1-81)和甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目(2019GAAS41)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360336), the Program of Science and Technology of Lanzhou (2019-1-81), and the Youth Fund of Gansu Academy of Agricultural Sciences (2019GAAS41).

夏先春, E-mail: xiaxianchun@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

楊芳萍, E-mail: yfp1023@163.com; 劉金棟, Liujindong_1990@163.com

2019-04-02;

2019-06-24;

2019-07-19.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190719.1457.006.html

10.3724/SP.J.1006.2019.91026