電針委中穴對腰椎退變大鼠腰椎間盤中NFAT5表達的影響

朱杭 陶其杰 林士明 唐成坤 潘浩

隨著人們勞動方式和生活方式的改變,椎間盤退變的發病率逐年上升,呈現年輕化趨勢[1].據統計由腰椎間盤退變引起的腰痛患者占門診的60%~80%,其中約11%~12%的患者生活質量受到嚴重影響[2-3],防治腰痛、延緩椎間盤退變逐年受到重視.近年來,有學者發現滲透壓與椎間盤退變過程有緊密聯系,維持滲透壓平衡在緩解椎間盤退變中維持著重要作用.目前已知電針在防治腰椎間盤退變引起的腰痛中有較好療效,對其延緩退變和緩解疼痛的機制也有一定了解[4-7].故本研究通過制作去雙前肢誘導直立大鼠模型,模擬人椎間盤的自然退變過程,觀察電針委中穴對模型大鼠腰椎間盤組織中滲透壓核轉錄因子5(NFAT5)表達變化,探討委中穴在防治腰椎間盤退行性變的可能機制.

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選用正常離乳SD大鼠(3周齡)32只,雌雄不限,由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供.在標準條件下常規飼養1周后,按隨機數字表法分為正常組、模型組、電針委中穴組、電針非穴組,每組各8只.

1.2 實驗設備和實驗試劑 選用低溫離心機、金屬恒溫箱、正置光學顯微鏡、成像系統(日本尼康);石蠟包埋機、病理切片機、烤片機(武漢俊杰);酶標儀(美國 TEK-BIO 儀器廠);普通PCR儀(ABI 公司)、華佗牌G6805電針儀(蘇州產); Trizol裂解緩沖液(北京鼎國);甲酰胺(Sigma 公司),溴乙錠(Sigma 公司),焦碳酸二乙酯(DEPC,Sigma 公司);OligoDNA引物合成(委托北京鼎國生物技術有限責任公司合成);阿利新藍染色液(武漢谷歌生物)等.

1.3 去雙前肢誘導直立大鼠模型的建立 參照Liang'等[8]的方法制作去雙前肢誘導直立大鼠模型(以下簡稱雙足鼠).除空白組外余下24只大鼠按35mg/kg給予3%濃度戊巴比妥鈉,進行麻醉后,隨后予以腋下備皮、碘伏消毒,取上臂中上1/3 處橫向切開皮膚,逐層剝離,暴露三角肌下血管神經束,予以絲線結扎,再用組織剪剪斷肌肉、血管和神經,用咬骨鉗咬斷肱骨,碘伏擦拭后逐層縫合.整個實驗過程在(37±0.5)℃的溫度下進行,術后4-0絲線逐層縫合.并給予抗炎藥物肌肉注射.術后置于特制飼養籠內,食物及飲水裝置放于鼠直立位可觸及高度,同期選取大小合適的特制塑料管,將雙足鼠放置于管中使其被迫站立,10h/d.

1.4 各組處理方法 到達造模周期后隨機抽取雙足鼠與空白組大鼠各一只,分別處死取腰椎間盤組織行阿爾新藍染色,確認造模是否成功.造模成功后模型組、電針委中穴組、電針非穴組共21只造模大鼠,每組各7只.空白組:飼養在特制鼠籠,無特殊處理;模型組:建立雙足鼠模型,不予電針處理.電針組:于造模成功后第1天開始行電針治療30min/(次.d),連續治療15d.治療方法:定位參照李忠仁主編《實驗針灸學》[9],取大鼠雙側委中穴,予以剪毛,助手拉直大鼠的膝關節,運用雙極聯體針[10]直刺0.3cm,快速提插捻轉至針下有沉澀感后,接通SDZ-II型華佗牌電針治療儀,參數為疏密波,2Hz/15Hz,刺激強度為1~2mA,針刺強度以部位輕微抖動為宜,30min/(次.d),連續治療15d;非穴組的對照點設在委中穴內側旁開0.3cm,余治療同委中穴組.

1.5 觀察指標及檢測方法 治療周期結束后,根據大鼠體重按35mg/kg給予3%濃度戊巴比妥鈉予以麻醉,取出L1-L5脊椎置于冰上進行操作,快速取出對應椎間盤,經PBS沖洗后,放置在預冷的4℃4%多聚甲醛中,固定24h.NFAT5及有機滲透轉運蛋白mRNA表達檢測:從GenBank獲取目的基因mRNA的全長序列,利用引物和探針設計軟件Primer 5.0設計引物序列.經Blast分析,引物序列都具有特異性.所用的引物及內參照β-actin引物(引物均委托北京鼎國生物技術有限責任公司合成)所示:

目的基因 引物序列NFAT5 5'-CGACAGTGCCAAAGCACCTC-3'5'-AACCGGATACTGTCCACACAACAT-3'BGT 1 5'-GACAAGGACCAGGTGAAGGAT -3'5'-AGGCAAGGATGATGATFTAGTAGA-3'TauT 5'-GCGGTGATAACTTATATGACGGTAT-3'5'-GGCAGAGGAGGATGACAATGA-3'AR 5'-TTTCCTTCTTTCTTTTTCTTCTTCT-3'5'-GGTTTTTTTACTCTCTCTGTTTGTT-3'β-actin 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'

取腰椎間盤組織,采用Trizol法提取總RNA,完成后定量.實時定量PCR 反應條件:95℃、30s,95℃、30s,60℃、34s,共進行45個循環.以β-actin作為內參照.實驗結果以ABI 7500軟件進行分析.其相對定量值使用比較Ct法進行計算,計算公式為.

1.6 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件.計量資料以(±s)表示,組間比較若滿足正態性且方差齊時采用單因素方差分析LSD法和SNK法,方差不齊時選擇Tamhane T2和DunnettT3法進行方差檢驗和兩兩比較,若不滿足正態性時采用秩和檢驗.P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 椎間盤組織病理學變化 術后4個月,分別隨機選取1只雙足鼠和1只正常組大鼠,予以腹腔麻醉后取腰椎間盤行阿爾新藍染色能與蛋白多糖結合呈現藍色,骨組織不著色.正常組(見圖1A),鏡下可見椎間盤中央完整的髓核和纖維環結構清晰、層次分明,與髓核界線清楚,髓核內有豐富的空泡細胞和小的類軟骨樣細胞,髓核內細胞聚集在其中,整體髓核組織染色較深.模型組(見圖1B):椎間盤纖維環排列紊亂甚至斷裂,髓核縮小,髓核內網格樣結構消失,髓核和纖維環界線不清,整體椎間盤組織染色較淡.提示本次造模成功.

圖1 大鼠腰椎間盤組織結構觀察

2.2 各組大鼠椎間盤組織中NFAT5、TauT、AR及BGT1 mRNA表達情況 Real-Time PCR結果顯示:與正常組比較,模型組椎間盤內NFAT5、BGT1、AR及TauT mRNA表達含量顯著減少,差異具有統計學意義(P<0.05), 且 NFAT5及 BGT1、TauT、AR mRNA呈現正向關系;與模型組比較,電針組NFAT5 mRNA表達含量均有上升,其中電針委中穴組升高更為明顯(P<0.05),電針非穴組雖有表達,但差異無統計學意義(P>0.05);NFAT5及 BGT1、TauT、AR mRNA在電針委中穴與電針非穴組中均有表達,但前者較后者顯著(P<0.05)(見表1、2).

表1 椎間盤退變后各組大鼠NFAT5 mRNA的表達情況(±s)

表1 椎間盤退變后各組大鼠NFAT5 mRNA的表達情況(±s)

注:與正常組比較,*P<0.01,#P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與電針委中穴比較,◇P<0.05

組別 數量(只) NFAT5含量正常組 7 1.29±0.207模型組 7 0.78±0.185*電針委中穴組 7 1.06±0.164#△電針非穴組 7 0.85±0.193*◇

表2 各組大鼠椎間盤內BGT1、TauT、AR mRNA的表達情況(±s)

表2 各組大鼠椎間盤內BGT1、TauT、AR mRNA的表達情況(±s)

注:與正常組比較,*P<0.01,#P<0.05;與模型組比較,▲P<0.01,△P<0.05;與電針委中穴比較,◇P<0.05

組別 數量(只) BGT1 mRNA TauT mRNA AR mRNA正常組 7 1.04±0.099 0.99±0.246 1.13±0.132模型組 7 0.67±0.140* 0.44±0.173* 0.48±0.158*電針委中穴組 7 0.86±0.198#△ 0.72±0.202#△ 0.66±0.122*▲電針非穴組 7 0.70±0.059*◇ 0.49±0.130*◇ 0.51±0.143*◇

3 討論

普遍認為腰椎間盤退行性變是直接產生腰痛的主要原因.祖國醫學尚無"腰椎間盤退變"的診斷,通過結合患者臨床癥狀可以歸為"痹癥"、"腰痛"范疇.委中穴是治療腰椎退變疾病的常用穴位,《乾坤生意》記載:"腰背委中求",是對其主治作用的經典概括.委中穴又名"血郄"、"郄中"等,屬于足太陽膀胱經的合穴.白亞楠等[11]通過收集27部古籍中治療腰痛病案并進行匯總,發現委中穴使用頻次最多,達25次.現代醫學發現:支配委中穴的傳入神經投射到脊髓的節段與腰背部神經節段的分布在后根神經節與脊髓存在部分重疊,在神經解剖學上得到客觀論證.近年來,國內外學者從炎癥反應、局部血流、神經再生、疼痛物質改變和肌纖維修復等多方向進行相關研究[4-7],使委中穴防治腰椎間盤退變疾病的機制有了深一步的了解.

NFAT5作為Rel蛋白家族之一,有與NFAT家族相似的序列,也是目前唯一已知在哺乳動物體內由滲透壓激活的轉錄因子,通常分布于腎臟、關節、晶狀體、椎間盤等已知的高滲組織中.高滲刺激下,磷酸化的NFAT5進入胞核進行核易位、活性轉錄調節及NFAT5合成三步驟,通過自身調控使細胞發生了一系列適應性改變以防止其結構和功能產生損害.另外,通過結合滲透轉運體的TonE/ORE序列調控轉運蛋白包括?；撬徂D運蛋白(TauT)、醛糖還原酶(aldose reductase,AR)、鈉離子三甲銨乙內酯(BGT-1)形成,促進有機滲透物質入胞內,平衡內環境.研究發現髓核細胞所生長的環境是一個偏向低氧、低PH及高滲的生態龕.高滲環境可以促使髓核組織在高載荷作用下維持對水分子的吸附力,椎間盤組織通過利用髓核組織自身生理特點和調節胞外基質的水合狀態從而達到承載日常脊柱壓力,分散載荷.然而隨著人體姿勢的改變,椎間盤組織承受體重和肌肉不同因素的聯合作用,椎間盤內水合狀態時刻發生改變,晝夜滲透壓發生改變,使得髓核細胞內環境紊亂,從而影響細胞結構和功能產生損害,造成椎間盤退行性變.本次實驗顯示空白組中的NFAT5表達含量明顯高于模型組(P<0.05),說明NFAT5是正常椎間盤滲透環境中髓核細胞存活和功能所必需的滲透轉錄因子,調節參與基質穩態以響應滲透壓的改變;AR負責催化山梨醇的生成、TauT及BGT1則分別負責有機滲透物質?；撬岷吞鸩藟A的積聚[12],有機滲透物可以保護生物分子免受由滲透壓和脫水改變引起的損害,從而提供細胞保護和抗炎作用.實驗中AR及TauT、BGT1mRNA表達量的顯著升高,提示滲透轉運蛋白對維持髓核細胞內外的滲透壓平衡起到一定促進作用.椎間盤退變常伴隨滲透壓的下降,所處的低滲環境可能影響NFAT5的表達,與本次結果相符.

本次實驗造模選用的去雙前肢誘導大鼠直立模型是目前國際上公認的造模方法,與空白組比較,模型組椎間盤纖維環排列紊亂甚至斷裂,髓核縮小,髓核內網格樣結構消失,髓核和纖維環界線不清,整體椎間盤組織染色較淡.提示雙足鼠造模雖然耗時較久,但相較于其他造模法,更符合人類脊柱的運動學及生物力學特點.實驗中模型組的NFAT5及滲透轉運蛋白(AR、BGT-1、TauT)表達較電針委中穴組呈下降趨勢(P<0.01),作者推測委中穴能夠正向調節NFAT5表達,達到維持椎間盤內環境平衡.與電針非穴組比較,委中穴的NFAT5及AR、BGT-1、TauT含量增高,差異具有統計學意義(P<0.05),提示委中穴組與非穴組兩者之間的存在差異性,可能與經穴自身結構特異性相關,也說明經穴與非經穴兩者間在療效特異性上存在一定差異.