蛻皮甾酮對糖皮質激素誘導成骨細胞增殖及分化的影響

湯樣華 羅淦 熊振飛 岳振雙 辛大偉 曾林如*

糖皮質激素臨床應用廣泛,如器官移植、惡性腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病等多種疾病的治療.但是長期接受糖皮質激素治療卻可導致骨質疏松[1-3].因糖皮質激素誘導的骨質疏松是繼發性骨質疏松癥的較為常見的致病因素.糖皮質激素能抑制成骨細胞增殖和分化,誘導細胞凋亡,導致細胞數量和功能的改變,最終表現出骨壞死、骨質疏松和減少骨形成.β-蛻皮甾酮(β-Ecd)為牛膝的活性成分之一.實驗研究發現[4-5],一定劑量的β-Ecd可提高成骨細胞的活性而同時抑制破骨細胞的活性,有效干預糖皮質激素所致小鼠骨密度的下降.也有報道β-Ecd對成骨樣細胞的增殖表現出顯著的促進作用[6].但關于β-Ecd對糖皮質激素誘導成骨細胞分化影響的文獻報道并不多.本研究通過體外分子實驗,觀察補腎中藥牛膝活性成分β-Ecd干預糖皮質激素誘導的成骨細胞的分化及影響情況,探討其防治糖皮質激素性骨質疏松癥的作用機制,以期為臨床應用提供實驗依據.

1 材料和方法

1.1 實驗動物 4~5周齡清潔級Wistar雄性大鼠由上海實驗動物公司提供,體重180~220g,許可證號SCXK(滬)2016-0004.

1.2 實驗材料 β-Ecd購自上海純優生物科技有限公司;地塞米松(Dex)注射液購自浙江仙踞制藥股份有限公司;阿侖膦酸鈉注射液購自青島捷世康生物科技有限公司;含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM/F12細胞培養基購自美國Thermo Fisher Scientific公司;BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;ALP試劑盒購自美國Sigma公司;CCK-8細胞計數試劑盒購自上海甄準生物科技有限公司.

1.3 方法 (1)骨髓間充質干細胞與成骨細胞的培養:取4~5周齡清潔級Wistar雄性大鼠,麻醉后頸椎脫臼處死,無菌狀態下分離股骨和脛骨,剔凈周圍軟組織.剪除兩端骨組織,暴露骨髓腔,緩慢從一端注入含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM/F12細胞培養基,以沖出骨髓內細胞.輕柔吹打數次,40μm過濾器過濾,得到單細胞懸液.離心5min(1500 r/min)后,棄上清液,用含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM/F12制成單細胞懸液,接種于25cm培養瓶內,放置于37℃、濕度100%、5%的CO2的培養箱內培養.換液1次/3d.待原代細胞生長鋪滿瓶底>80%時,加入0.25%胰蛋白酶進行消化傳代培養至第3代.然后將骨髓間充質干細胞接種于密度為5X104的24孔板中,在含10% FBS、50mg/L維生素C、10-3mol/L b-甘油磷酸鈉、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素和10-8mol/LDex的成骨細胞優化培養液中,放置于37℃、濕度100%、5%的CO2的培養箱內培養.誘導14d后,采用堿性磷酸酶(ALP)染色法對分化的成骨細胞加以鑒定.(2)不同濃度Dex對成骨細胞ALP活性影響的檢測:成骨細胞在96孔板上進行培養,用不同濃度Dex(10-9~10-4mol/L)處理成骨細胞72h,用ALP試劑盒測定ALP活性.(3)β-Ecd對Dex誘導成骨細胞的干預作用:實驗分組:將所培養的成骨細胞在12d后進行分組,分為空白對照組(未予任何藥物干預)、Dex組、Dex+阿侖膦酸鈉(ALN)組;Dex(Dex)+β-Ecd組.細胞增殖及ALP表達檢測:成骨細胞在96孔板上進行培養,在加入Dex基礎上,分別加入阿侖膦酸鈉(10-5mol/L)、β-Ecd(10-4~10-9mol/L,上海純優生物科技有限公司,中國上海),作用處理24h、48h、72h,在處理結束時(24h、48h和72h),細胞計數試劑法(CCK-8)(BioTek Instruments,USA)檢測細胞增殖,用分光光度法測定了450nm處的吸光度.用ALP試劑盒檢測各組細胞ALP的表達.RT-PCR檢測相關基因mRNA 表達:設計相關基因的引物(Runx2,RANKL,OCN,ATG5等).將各引物溶解、稀釋成10μmol/L濃度,低溫凍存.用Trizol提取各組細胞總RNA,將RNA溶于Formamide,分裝,低溫保存.將RNA溶液用Biophotometer 檢測RNA含量(μg/μl).以5μg RNA為模板,利用AMV逆轉錄酶將各組細胞RNA反轉錄合成cDNA,將各cDNA低溫凍存備用.實時熒光定量PCR 儀檢測各組細胞各基因表達情況.以2-△△CT法檢測各組細胞各基因表達豐度.

1.4 統計學分析 采用GraphPad Prism 5軟件及GraphPad軟件分析.計量資料以(±s)表示,采用非配對雙尾t檢驗進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 Dex誘導成骨細胞分化及Dex、ALE、β-Ecd對成骨細胞的抑制作用 誘導14d后,成骨細胞開始發育,細胞外基質呈強紫色,表明成骨細胞誘導成功.與空白對照組比較,Dex在較低濃度(10-9~10-8mol/L)下能明顯刺激ALP活性,在較高濃度(10-7~10-4mol/L)時抑制ALP活性,且兩者均呈劑量依賴性.不同濃度的β-Ecd(10-7~10-5mol/L)對ALP活性的刺激作用與單獨使用Dex(10-6mol/L)和ALE(10-5mol/L)相似.

2.2 β-Ecd對成骨分化的誘導作用 Dex(10-6mol/L)能顯著降低Runx 2和OCN的表達,而RANKL在mRNA和蛋白質水平上則均表現為顯著增加(圖1AD).不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd對Dex誘導的成骨細胞Runx2、OCN和RANKL表達的變化呈劑量依賴性逆轉作用(圖1A~D).

2.3 β-Ecd對Dex誘導成骨細胞增殖的影響 與空白對照組比較,低濃度Dex(10-9~10-8mol/L)處理24h后細胞增殖明顯增強(圖2A),而高濃度(10-6~10-4mol/L)則抑制細胞增殖(圖2B、C).不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd作用24h對細胞增殖無明顯促進作用(圖2D),但作用48h、72h與單用Dex(10-6mol/L)處理比較,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2E、F).

3 討論

圖1 不同實驗組對Dex誘導的成骨細胞Runx 2、OCN和RANKL表達的影響

圖2 β-Ecd對Dex誘導成骨細胞增殖的影響

在體外分化過程中,成骨細胞表型標志依次為Ⅰ型膠原基質的形成、ALP的表達、Runx2的表達、骨鈣素(OCN)的分泌以及骨結節的礦化.其中Runx2是一種重要的轉錄因子,控制著諸多隨后發生的成骨分化相關基因表達事件.ALP是與骨形成有關的代謝指標,是成骨細胞發揮成骨作用的關鍵酶,能直接反映成骨細胞活性,是骨折愈合和骨重建的重要生物標志.本研究發現不同濃度的β-Ecd(10-7~10-5mol/L)對ALP活性有促進作用,其刺激作用和ALE(10-5mol/L)相似.研究[7]還發現BMP、RunX2、ALP、Osteonectin等基因是BMSCs成骨分化過程中比較關鍵的基因.而且BMP還是BMP-2骨細胞分化信號通路的主要成員之一,RunX2是BMP-2的靶基因,兩者互為信號通路作用的關鍵因子,通路激活能夠促進成骨分化,并調節分化過程中ALP、Osteonectin等相關基因的表達,對骨組織的重建有重要的意義.OCN是另一個在分化過程中表達較晚的標記.RANKL是一種膜結合腫瘤壞死因子(TNF)受體,其主要由成骨細胞和"T"淋巴細胞分泌的跨膜蛋白組成,表達于成骨細胞前體細胞上,通過細胞與細胞的直接相互作用識別破骨細胞表面的秩[8].在本實驗中通過ALP表達檢測、RT-PCR及蛋白質提取與蛋白質印跡檢測發現,Dex(10-6mol/L)能顯著降低Runx 2和OCN的表達,而RANKL在mRNA和蛋白質水平上則均表現為顯著增加,并顯示Dex對成骨細胞分化的影響與其濃度和實驗條件密切相關.不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd對Dex誘導的成骨細胞Runx2、OCN和RANKL表達的變化有依賴性的逆轉作用,類似于ALE(10-5mol/L)對成骨細胞的作用.

另有研究[9]報道成骨細胞是糖皮質激素作用于骨的主要位點,成骨細胞對糖皮質激素有特異性受體并且具有高度親和力,并通過與其特異性受體結合.生理劑量的糖皮質激素是通過促進成骨細胞前體的聚集、成熟,進入刺激成骨細胞分化.而超生理劑量則可抑制成骨細胞的增殖、分化,導致骨形成減少.本實驗中高濃度Dex(10-6~10-4mol/L)表現為抑制成骨細胞增殖.而不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd作用48h、72h,則對成骨細胞增殖有較為明顯促進作用.這一結果也進一步表明β-Ecd對激素性骨質疏松的正面干預作用.

綜上所述,本研究中成功建立了Dex誘導的成骨細胞模型,為糖皮質激素骨質疏松癥的基礎研究提供細胞來源,并初步明確了Dex對成骨細胞分化和增殖的影響,同時還發現β-Ecd能以劑量依賴性的方式逆轉Dex對成骨細胞分化和增殖的抑制.這些結果將為β-Ecd治療糖皮質激素骨質疏松癥提供強有力的理論支持.