響應面分析法優化一株窖泥源酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）RL1菌株產丁酸發酵培養基

彭志云，趙 東，胡曉龍，何培新，張 勇，鄭 燕，牛廣杰

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007；2.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；3.河南省百泉春酒業有限公司，河南新鄉 453000）

丁酸（Butyric Acid）是一種重要的四碳短鏈有機酸，廣泛地應用于化工、食品和制藥等行業。丁酸及其衍生物有多種用途，比如，丁酸可作為生產塑料和纖維制品的添加劑以增加其柔韌性、疏水性和耐光性[1]，也可以通過生物轉化為丁醇來緩解石油能源枯竭和日益增長的需求壓力，是一種具有巨大潛力的能源物質；丁酸酯可作為飲料、食品以及化妝品中的果味香料[2]；丁酸在胰島素抵抗以及血紅蛋白病和直腸癌的治療等方面的應用具有很大潛力[3-5]。厭氧條件下，丁酸可以由不同種屬細菌菌株產生，而梭菌屬由于具有較高的丁酸產率和產量被選作丁酸生產的優勢種屬，目前用于工業化研究的梭菌屬細菌主要有C.tyrobutyricum[6-12]、C.butyricum[13-15]和C.thermobutyricum[16]，而C.tyrobutyricum因能夠產生高濃度丁酸且具有高酸耐受性、高選擇性等優勢，成為丁酸工業化發酵生產研究的最佳菌株。

響應面法(response surface methodology,RSM)是一種開發、改進和優化多個變量對目標物響應變化的有力工具，它將統計學與數學相結合，通過建立和分析回歸方程來量化目標產物特性與過程變量之間的函數關系[17]。與單因素試驗和正交試驗相比，RSM 不僅能夠研究變量之間的交互作用，而且因為試驗次數少、周期短、回歸方程精確度高等優勢廣泛地應用于生物、化工、食品、農業等領域。

培養基是微生物生長和發酵的基礎，培養基中的成分和濃度對丁酸的生產具有很大影響，本研究采用響應面法來優化C.tyrobutyricumRL1 發酵培養基來提高丁酸的產量，首先通過Plackett-Burman設計對培養基中的9 個主要因素進行篩選，找出影響丁酸產量的顯著因素，再利用最陡爬坡實驗逼近最大響應區域，最后通過Box-Behnken 設計及響應值分析來確定顯著影響因素的最佳濃度，從而獲得C.tyrobutyricumRL1的最佳發酵培養基。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 供試菌株

C.tyrobutyricumRL1，本實驗室前期從窖泥中分離保存。

1.1.2 主要試劑

丁酸、2-乙基丁酸（色譜純），購自日本TCI 公司；其余試劑均為市售分析純。

1.1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS），上海申安醫療器械廠；超凈工作臺（SW-CJ-ID 型），蘇州凈化設備有限公司；厭氧產氣袋（C-11）、培養袋（C-41），日本三菱；智能生化培養箱（SHP-250），上海鴻都電子科技有限公司；電子天平（ME204E），梅特勒-托利多儀器有限公司；離心機TGL-16G，上海安亭科學儀器廠；氣相色譜儀（7820A）和HP-INNOWAX 毛細管色譜柱（30 m×0.255 mm×0.25 μm），美國安捷倫公司。

1.1.4 培養基的制備

種子活化培養基：即增強梭菌培養基（RCM 培養基），參照Hu[18]文獻中報道的方法配制。

基礎培養基（g/L）：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨5，氯化鈉5，乙酸鈉3，磷酸氫二鉀2.5，七水合硫酸鎂0.6，硫酸銨3，七水合硫酸亞鐵0.03，硫代乙醇酸鈉0.5，碳酸鈣5，pH6.8，121 ℃滅菌20 min，培養基中葡萄糖和碳酸鈣均與其他組分分開滅菌，于接種前加入。

1.2 試驗方法

1.2.1 RL1菌株種子的活化和培養方法

取-20 ℃甘油保藏的菌懸液300 μL 接種于裝有10 mL 種子活化培養基的試管中，于添加除氧劑的厭氧袋中34 ℃厭氧活化培養24 h，作為一級種子。將一級種子以3 %（v/v）的接種量轉接至工作體積為100 mL 且裝液量同為100 mL 的厭氧瓶中（在RL1 產氣后接入無菌輸液管用于排氣），34 ℃恒溫培養12 h，作為二級種子。將活化好的二級種子以3 %（v/v）的接種量轉接至上述同樣條件的厭氧瓶中，34 ℃恒溫靜置培養72 h。

1.2.2 發酵液前處理

取培養72 h 的發酵液15 mL，10000 r/min 離心10 min 去除菌絲體及碳酸鈣，取10 mL 稀釋適當倍數的上清液，加25 μL 72 %硫酸進行酸解，使上清液中的有機酸游離出來，加入40 μL 2-乙基丁酸作為內標充分混勻，乙醚萃取，再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾即得待測液。

1.2.3 發酵液中丁酸濃度的定量分析

發酵液中丁酸濃度的檢測采用氣相色譜（GC）和內標法進行定量分析。

1.2.3.1 標準曲線的繪制

用RCM 培養基準確配制50 mg/mL 的丁酸母液，并依次稀釋配成8 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 的標準溶液（每個濃度平行3次）。每個濃度梯度的標準溶液取10 mL，加入40 μL 2-乙基丁酸（內標）充分混勻，乙醚萃取，經孔徑為0.22 μm 微孔濾膜過濾，上樣。以標準品濃度為縱坐標，丁酸與內標的峰面積比為橫坐標，繪制標準工作曲線。

1.2.3.2 色譜條件

采用安捷倫7820A 氣相色譜儀進行丁酸濃度檢測。色譜條件參照陳興杰等的報道[19]并稍作修改：進樣口溫度200 ℃，柱箱起始溫度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 的升溫速率升溫至220 ℃，保持2 min。檢測器溫度250 ℃；氣體流量：氫氣35 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣20 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比為20∶1；進樣體積：1 μL。

1.2.4 培養基優化試驗設計

1.2.4.1 Plackett-Burman設計

利用Plackett-Burman 設計考察基礎培養基中的9 個成分對RL1 產丁酸的影響。通過Design-Expert.8.05b 軟件對試驗進行設計，選取試驗次數N=12 的設計方案，考察因素及編碼值分別為葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、蛋白胨(X3)、乙酸鈉(X4)、氯化鈉(X5)、七水合硫酸鎂(X6)、硫酸銨(X7)、七水合硫酸亞鐵(X8)和碳酸鈣(X9)，每個因素選取高低兩個水平，分別用+1和-1表示。具體試驗設計方案見表1。

1.2.4.2 最陡爬坡試驗

響應面擬合方程需要建立在最佳值區域附近才能充分反映真實情形。最陡爬坡試驗是一種能夠快速有效地接近最佳響應區域的試驗方法，它以Plackett-Burman 實驗擬合模型為基礎，根據顯著因素效應的正負及大小來設定爬坡方向及變化步長，而其他非顯著因素既可根據效應的正負和大小設定（例如表現為正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值），也可從經濟角度出發選取較低值。

1.2.4.3 Box-Behnken設計

響應面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是一種解決多變量問題的常用統計方法，它通過合理的試驗設計得出相應的數據并建立多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系從而確定最佳工藝參數。

根據Plackett-Burman 試驗和最陡爬坡試驗找出試驗的顯著因素與水平，采用Box-Benhnken 設計對發酵培養基組分進行響應面分析試驗。每個因素取低中高3 個水平，編碼為(-1，0，1)，試驗的設計及結果分析均采用軟件Design-Expert.8.05b。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

將配制好的不同濃度的丁酸標準溶液按照上述方法處理并進行氣相色譜檢測，每個濃度做3 個平行樣品。取丁酸和2-乙基丁酸峰面積比的平均值，以丁酸濃度（g/L）為縱坐標，丁酸與2-乙基丁酸的峰面積之比(A/A)為橫坐標作圖（圖1），得到丁酸的標準曲線回歸方程為y=5.9716x+0.4495（R2=0.9987,n=5）。

圖1 丁酸標準曲線

2.2 Plackett-Burman試驗篩選顯著影響因素

把發酵液中的丁酸濃度（g/L）作為因變量，采用Plackett-Burman 試驗研究培養基中各組分對RL1 產丁酸的影響，篩選出對丁酸生成影響顯著的因素。試驗設計及結果見表1。利用Design-Expert 8.05b 軟件對表1 結果進行統計分析，Plaekett-Burman 試驗中各因素水平的濃度以及顯著性分析結果如表2 所示。由表中信息可知，整體模型顯著，且在α=0.05 的顯著水平上，對丁酸生成影響顯著的3 個因素分別是葡萄糖(X1)、碳酸鈣(X9)、蛋白胨(X3)。選取這3個因素進行下一步操作試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果

表2 Plackett-Burman試驗結果分析

2.3 最陡爬坡實驗設計及結果

對Plackett-Burman 的試驗結果分析找出對丁酸生成影響不顯著的因素，其中起正效應作用的酵母粉、乙酸鈉和氯化鈉取高水平值，起負效應的七水合硫酸鎂、硫酸銨和七水合硫酸亞鐵取低水平值。對丁酸生成具有顯著正效應作用的葡萄糖、碳酸鈣和蛋白胨的變化方向以及步長的設計及結果見表3。

2.4 Box-Behnken設計篩選顯著因素的最佳濃度

2.4.1 Box-Benhnken試驗設計及方差分析

通過Plackett-Burman 試驗確定對丁酸生成影響顯著的因素，再由最陡爬坡試驗確定其接近響應值區時的濃度，最后采用Box-Benhnken 試驗設計進行響應面分析，顯著因素的水平見表4，Box-Behnken試驗設計表及結果見表5。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果 (g/L)

表4 響應面因素設計水平表

以發酵液中丁酸濃度為響應值，利用Design-Expert.8.05b 軟件對表5 中的試驗結果進行二次回歸分析，得到的回歸分析模型方程為：

表5 Box-Behnken試驗設計表及結果

該模型可信度分析結果及模型回歸方程的方差分析分別見表6和表7。

表6 模型可信度分析

表7 回歸方程的方差分析表

模型可信度分析見表6，其中決定系數R2=0.9921，表明該模型可以解釋99.21 %試驗中響應值的變化，方程擬合度較高。變異系數可以衡量試驗中各觀測值變異程度的大小，其值越低，試驗的可靠性越高。本試驗中CV=1.27%，數值較低，說明試驗操作的準確度較高，操作可信。信噪比是判斷模型是否能夠提供充足信息以進行數據分析的一個重要參數，當信噪比大于4 時，可以認為模型能提供足夠的信號，本試驗中信噪比為24.021，符合分析所需要求。綜上表明，該模型可信度較高，可以用來分析和預測RL1的最佳培養基成分。

由表7 可知，該多元二次回歸方程模型的顯著性檢驗P=0.0001，遠遠低于0.05，表明該模型具有良好的統計學意義。自變量X1、X2及二次項X1X2、X2X3、X12、X22、X32相關系數的P＜0.05，表明這些因素以及因素之間的交互作用會顯著影響發酵液中丁酸的生成。失擬項代表試驗數據與模型的擬合程度，本試驗P=0.5439＞0.05，失擬不顯著，因此該回歸方程可以代替真實數據對試驗結果進行分析。

2.4.2 響應面與等高線

保持3 個因素中任一因素處于中間值不變，可以分析剩余兩個因素之間的相互作用。利用Design-Expert.8.05b 軟件繪制響應面分析圖及等高線，葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與碳酸鈣以及蛋白胨與碳酸鈣之間的交互作用對響應值的影響分別見圖2、圖3、圖4。

葡萄糖是RL1 發酵產丁酸的物質基礎。由圖2、圖3 可知，在一定范圍內，發酵液中的丁酸濃度隨著葡萄糖濃度的增加不斷升高，當葡萄糖濃度大于85.29 g/L時，丁酸濃度不再升高且隨著葡萄糖濃度的增加逐漸降低，丁酸的合成受到抑制。其原因可能是，RL1 主要利用葡萄糖發酵生產丁酸，葡萄糖濃度越高，對丁酸的生成越有利，但隨著發酵過程中丁酸濃度的不斷增加，培養基中的pH 值一直降低，當pH 值降低到某個特定值時，菌體的生長以及代謝產物的生成開始受到抑制，而且這種抑制作用隨著發酵的進行不斷增強。此外，葡萄糖的過度代謝也會加速其他酸性副產物（如乙酸等）的積累，導致pH值迅速降低。

圖2 葡萄糖和蛋白胨對丁酸生產影響的響應面圖及等高線圖

圖3 葡萄糖和碳酸鈣對丁酸生產影響的響應面圖及等高線圖

圖4 蛋白胨和碳酸鈣對丁酸生產影響的響應面圖及等高線圖

氮源是構成生物體蛋白質、核酸及其他含氮化合物的基礎，在微生物生長代謝過程中起著至關重要的作用。蛋白胨含有豐富的氮源、氨基酸等，是微生物發酵常用且重要的氮源物質，但是過量的蛋白胨也會抑制丁酸的生成，由圖2和圖4可知，當蛋白胨濃度大于9.37 g/L時，隨著蛋白胨濃度的增加，丁酸濃度逐漸降低。

微生物生長過程中pH 值對菌株生長和代謝有至關重要的作用。隨著RL1 利用葡萄糖發酵產酸的進行，培養基中的pH 值開始逐漸降低，菌體生長越旺盛，產酸越多，pH 值降低得越快，因此在培養基中添加一定量的碳酸鈣，不僅可以給微生物提供微量鈣元素還可以對發酵過程中的pH 值的變化起緩沖作用，避免發酵液pH 值劇烈降低。由圖3、圖4 可知，當碳酸鈣的添加量低于11.6 g/L 時，隨著其添加量的增加，丁酸濃度逐漸增加，當達到11.6 g/L后，丁酸濃度不再上升，并開始降低，表明此時的碳酸鈣已經接近最大緩沖能力，增加碳酸鈣的添加量不僅不能緩解pH 值的降低，微溶于發酵液中過量的鈣離子也開始對丁酸的生成形成抑制作用。

綜合以上分析，當培養基中葡萄糖、蛋白胨、碳酸鈣的添加量分別為85.29 g/L、9.37 g/L 和11.6 g/L時，丁酸濃度達最大值。應用軟件深入分析，預測在這種情況下發酵液中丁酸的最大濃度為23.09 g/L。為檢驗模型可靠性，分別在優化前和優化后的培養基上進行重復試驗，得到基礎培養基上RL1 所產丁酸濃度為14.23 g/L，而最佳培養基上的丁酸濃度為22.96 g/L。試驗驗證結果與預測值接近，說明該模型可以真實地反映培養基中的主要組分對丁酸生成量的影響，且優化后較優化前丁酸濃度提高了61.35%。

3 結論

采用響應面分析法對RL1 產丁酸培養基進行優化。首先采用Plackett-Burman 設計對培養基中的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、乙酸鈉、氯化鈉、七水合硫酸鎂、硫酸銨、七水合硫酸亞鐵、碳酸鈣9 個因素進行篩選，確定出葡萄糖、碳酸鈣和蛋白胨是影響丁酸生成的顯著因素。改變3 種顯著因素的濃度，利用最陡爬坡路徑逼近最大產酸響應區域，通過Box-Behnken 設計及其響應值分析確定出最佳發酵培養基成分為(g/L)：葡萄糖85.29，酵母粉7.5，蛋白胨9.37，氯化鈉7.5，乙酸鈉4.5，磷酸氫二鉀2.5，硫酸鎂0.3，硫酸銨1.5，硫酸亞鐵0.015，硫代乙醇酸鈉0.5，碳酸鈣11.6，此時丁酸濃度最大預測值為23.09 g/L。對模型準確性進行試驗驗證，得到的實際濃度為22.96 g/L，培養基優化后的丁酸濃度較優化前的14.23 g/L提高了61.35%，優化效果顯著。