貴州不同產(chǎn)地雪膽藥材有效成分研究

王志春，陳薇薇，郭小梅，沈昱翔

(安順學(xué)院，貴州 安順 561000)

雪膽為西南民間常用藥材，基源為葫蘆科植物雪膽屬(Hemsleya)多種植物的塊莖。本屬植物按照中國植物志記載共31種，其中包括10個變種[1]，在我國西南地區(qū)都有分布[2]，其中貴州、云南、四川三省擁有全屬植物的92%[3，4]。雪膽具有抗菌消炎、清熱解毒等功效，在臨床治療冠心病、腸炎、氣管炎、慢性子宮頸炎、菌痢等多種疾病時都應(yīng)用到了此藥材，并對保肝、抗癌等也發(fā)著揮極大作用[5-8]；雪膽屬植物具有抗菌、抗炎、溶血、抗癌等活性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其含有葫蘆素和齊墩果烷兩大類三萜皂苷[9]。

貴州地區(qū)常稱雪膽屬藥用植物為“蛇蓮”“苦金盆”[10]，貴州地區(qū)亦是雪膽商品藥材的重要產(chǎn)地，當(dāng)?shù)囟嗝褡鍙V泛使用此類藥材，如貴州知名藥企“神奇藥業(yè)”著名民族藥“雪膽素片”就是以其為原料生產(chǎn)，因此雪膽屬植物為貴州省重要的藥用植物資源，但是目前關(guān)于貴州省雪膽藥材資源的相關(guān)研究較少。為保證用藥安全，本研究調(diào)查了貴州雪膽屬藥用資源的分布情況，并收集了貴州興義、畢節(jié)、安順、遵義、六盤水等不同產(chǎn)地的雪膽塊莖樣品，并對醇溶性浸出物、總黃酮、雪膽素甲和總皂苷含量進行了檢測并分析其相關(guān)性因素，以期為以后大規(guī)模的種植和資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

賽多利斯Bp211DAG電子天平(德國Sartorius公司)；Agilent1200 Series高效液相色譜儀(G1316B柱溫箱、G1312B四元梯度泵、G1315C二極管陣列紫外檢測器、G1322A脫氣機、G1329B自動進樣器)；超聲波清洗器KQ5200DB(昆山市超聲儀器有限公司提供)。

1.2 實驗材料

雪膽素甲(111518-201103)由中國食品藥品檢定研究院提供；齊墩果酸對照品、蘆丁對照品由阿拉丁試劑(上海)有限公司提供；水為重蒸餾水；乙腈為色譜純；乙醇、甲醇、冰醋酸、石油醚、硝酸鋁、正丁醇、高氯酸、香草醛、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

雪膽藥材收集于貴州不同產(chǎn)區(qū)，所有樣品均收集帶有地上部分的植株以利于鑒定，對應(yīng)塊莖帶回實驗室備用，樣品情況見表1。

2 研究方法

2.1 樣品處理

對貴州興義、畢節(jié)、遵義、安順、六盤水等雪膽藥材產(chǎn)地進行調(diào)查，查閱文獻資料，整理及分析貴州雪膽藥材的資源使用情況。清洗野外收集到的雪膽塊莖，對其鮮重進行稱量、切片，將其自然陰干，陰干后的材料研磨成粉末狀，用于總黃酮、醇溶性浸出物、雪膽甲素含量及總皂苷的檢測，每組實驗重復(fù)做5個。

2.2 雪膽甲素含量的測定

2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠填充；以乙腈∶水=40∶60，檢測波長為212 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取適量的雪膽素甲對照品，稱重，加乙腈，制成每1.0 mL含0.143 mg雪膽素甲的對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別稱取每個樣品粉末約1.0 g，稱定重量，置于帶瓶塞的錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱定重量，先超聲處理30 min，然后放冷，再稱定重量，減失的重量用甲醇補足，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.3 總皂苷含量的測定

2.3.1 供試液的制備 每個樣品各稱取粉末 1.0 g，加入70%乙醇15 mL，提取1 h，共提取5次。將濾液合并且揮干其溶劑，用蒸餾水定容至10 mL，先用20 mL石油醚脫脂，然后用適量正丁醇萃取并揮干萃取液，用 50%乙醇定容得到溶劑50 mL備用。

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取齊墩果酸對照品1.8 mg，置入燒杯，然后用甲醇溶解，并稀釋至 25 mL，作為對照品溶液。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 量取對照品溶液1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0 mL置于試管，放水浴鍋中加熱揮干其甲醇，加入新配5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，在65 ℃下水浴加熱20 min。放冷，待冷卻至室溫后加10 mL冰醋酸，并將其搖勻。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.426 4X-0.151 9，R1=0.999 5。

2.3.4 樣品溶液的測定 取0.6 mL樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定樣品，總皂苷含量的計算對照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進行[11]。

2.4 總黃酮含量的測定

參考鐘文等[12]所用方法制備供試液、對照品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.167 4X+0.036 8，R2=0.999 3。

2.4.1 樣品溶液的測定 量取1.00 mL黃酮提取液，置于 10 mL 容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜置 8 min；再加入 10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置8 min；加入 5%氫氧化鈉溶液 5 mL，再加水至刻度，搖勻，靜置20 min；總黃酮的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出。

2.5 醇溶性浸出物用熱侵法進行測定

參照《中國藥典》(2010年版1部)附錄 X A 醇溶性浸出物測定法[13]。精密稱取各樣品粉末2 g，各置于具塞圓底燒瓶(100 mL)中，加水50 mL，蓋上瓶塞，稱重，放置1h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸狀態(tài)1 h；放冷，冷卻后取下圓底燒瓶，蓋上瓶塞，稱定其重量，把減失的重量用水補足，搖勻后過濾；用量筒量取濾液25 mL，放入蒸發(fā)皿中，用水浴蒸干后，在105 ℃下，干燥3 h，移置干燥器中，冷卻1 h，立刻稱其重量；樣品中含水溶性浸出物的百分?jǐn)?shù)以干燥品來計算。

3 結(jié)果

3.1 貴州雪膽屬資源概況

根據(jù)《Flora of China》與《云南雪膽屬植物藥用資源的初步研究》的記載，貴州有8種、1原亞種、3原變種雪膽屬植物具有塊莖[14，15]，主要分布在貴州西部、西北部及東南部至西南部地區(qū)，由于其屬在貴州分布范圍較廣，本項目組實際收集到帶花、果等繁殖器官的雪膽植株標(biāo)本共7份，經(jīng)貴州省安順學(xué)院陳薇薇老師鑒定其基源為肉花雪膽(HemsleyacarnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)和雪膽(H.amabilisDiels)兩種，其中肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)主要分布在貴州西北部到西部海拔較高的區(qū)域(本次收集到肉花雪膽樣品海拔均為1 500 m以上)，資源量大，并且在畢節(jié)、黔西南等地已經(jīng)有一定規(guī)模的引種栽培，并形成商品；而雪膽(H.amabilisDiels)則分布在海拔較低區(qū)域，未見有大量栽培引種，多為當(dāng)?shù)孛耖g使用，商品量較少。

表1 雪膽屬藥材樣品調(diào)查結(jié)果

3.2 不同產(chǎn)地雪膽藥材有效成分含量及品質(zhì)差異

本研究收集到貴州7個雪膽樣品的雪膽甲素平均含量為1.39%，總黃酮的平均含量為2.24%，總皂苷的平均含量為0.78%，醇溶性浸出物的平均含量為17.09%。總體來看，貴州雪膽有效成分含量較高。其中樣品S3(桂果鎮(zhèn))的雪膽甲素含量最高，達4.46%，比平均含量高出3.07%；總皂苷含量最高的是樣品S3，含量為1.08%，比平均含量高0.30%；總黃酮最高的也是樣品S3，含量為5.19%，比平均含量高2.95%；醇溶性浸出物含量最高的樣品還是S3，含量為22.78%，比平均含量高5.69%。綜合分析雪膽甲素、總皂苷、總黃酮及醇溶性浸出物等多個指標(biāo)，樣品S3的藥材品質(zhì)優(yōu)良。本項目所收集的7個樣品中，基源為雪膽(H.amabilisDiels)的有3個，雪膽甲素的平均含量是2.27%，總黃酮的平均含量是2.99%，總皂苷的平均含量是0.96%，醇溶性浸出物的平均含量是16.47%。基源為肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)的有4個，雪膽甲素的平均含量是0.73%，總黃酮的平均含量是1.69%，總皂苷的平均含量是0.65%，醇溶性浸出物的平均含量是17.56%。結(jié)果表明，肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)的雪膽甲素、總皂苷、總黃酮均高于雪膽(H.amabilisDiels)，而醇溶性浸出物低于雪膽(H.amabilisDiels)。總體分析，不同產(chǎn)地雪膽藥材活性成分含量有差異，其中畢節(jié)市桂果鎮(zhèn)所產(chǎn)樣品有效成分含量高于六盤水市普古鎮(zhèn)、安順市貓營鎮(zhèn)等地樣品，品質(zhì)優(yōu)良；肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)藥材品質(zhì)優(yōu)于雪膽(H.amabilisDiels)藥材。檢測結(jié)果見表2和圖1。

表2 不同產(chǎn)地有效成分檢測結(jié)果 (%)

注：n=3。

圖1 不同產(chǎn)地雪膽有效成分含量差異

4 討論

雪膽是我國重要的藥用植物，作為民間藥材和原料藥材，具有較大的市場需求，然而目前主要依靠野生植株提供商品，加上長期掠奪性采挖，目前雪膽資源已經(jīng)出現(xiàn)危機，野生資源逐漸稀少。據(jù)文獻記載，貴州具塊莖雪膽共有8種、1原亞種、3原變種，但是本次調(diào)查僅收集到2種，即肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)和雪膽(H.amabilisDiels)，前者多分布于貴州西部、西北部海拔1 500 m以上區(qū)域的闊葉林下或灌木從中，而后者則分布在海拔1 000 m左右低海拔闊葉林中。在走訪過程中，據(jù)藥農(nóng)反映近年來雪膽的資源逐漸減少，個頭大的植株已多年不見，表明雪膽屬植物資源受到較嚴(yán)重的破壞，究其原因，可能與雪膽在多個地區(qū)的民間都有大量使用及商品收購，同時野生雪膽棲息環(huán)境被破壞等多種因素有關(guān)。目前市場上有多種以雪膽藥材為主要原料的藥品，甚至牙膏等日化用品的原料也有用到雪膽藥材，因此解決雪膽資源的日益減少勢在必行。在本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，僅有桂果鎮(zhèn)、七舍鎮(zhèn)等部分地區(qū)在進行小規(guī)模人工栽培，栽培雪膽的資源量遠遠不能滿足市場需求，資源的缺乏已對制藥企業(yè)帶來極大的困擾。因此，應(yīng)進一步研究雪膽植物的繁殖技術(shù)及繁殖方法，為規(guī)模化無性繁殖及人工馴化提供技術(shù)支撐。

本研究分析了貴州7個雪膽藥材樣品的主要藥用成分，包括雪膽甲素含量、總皂苷含量、總黃酮含量和醇溶性浸出物等，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的雪膽藥材在藥用成分含量上存在一定的差異，雪膽藥材品質(zhì)具有顯著的地域差異性。同時，根據(jù)實驗結(jié)果，貴州產(chǎn)肉花雪膽醇溶性浸出物的平均含量是22.78%，雪膽甲素的平均含量是4.46%，總黃酮的平均含量是5.19%，總皂苷的平均含量是1.08%，高于四川、浙江等地的藥材樣品[16，17]，同時肉花雪膽在貴州西北部地區(qū)，如畢節(jié)的桂果鎮(zhèn)、黔西南州七舍鎮(zhèn)等區(qū)域，已經(jīng)有一定的規(guī)模化引種栽培，并形成了商品，其種植技術(shù)、種源獲取等均較雪膽屬其他品種成熟，表明肉花雪膽是優(yōu)質(zhì)的雪膽藥材儲備資源，在今后的研究中應(yīng)該引起重視。

同時，雪膽藥材多用于提取如總皂苷等作為原料藥材使用，除塊莖外，尚有大量地上部分未被開發(fā)利用。林曉琴等[18]研究發(fā)現(xiàn)雪膽同屬植物馬銅鈴(H.gracilifloraCogn)，除塊莖外，花、葉、果實等也含有雪膽甲素等活性成分，因此我們可以進一步對貴州雪膽屬植物的莖、葉、果實等器官的有效成分進行研究，為開發(fā)、利用雪膽屬植物的非傳統(tǒng)藥用部位提供理論依據(jù)。