經方中黃芩-甘草不同配伍比例對黃芩苷溶出的影響

呂志陽，單 聰，楊雨微，顧雪梅，陳 璟，魏 穎

(南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300)

黃芩Radixscutellariae是雙子葉植物唇形科黃芩Scutellarbaicalensisgeorgi的干燥根，性寒，味苦，具有清熱燥濕、涼血止血、瀉火解毒等功效，其主要有效成分為黃芩苷。甘草RadixetRhizomaGlycyrrhuzae為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，味甘，性平，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功效。

黃芩與甘草是經典藥對，黃芩湯、葛根黃芩黃連湯等方劑出自《傷寒雜病論》，其中黃芩-甘草配伍比例是3∶2，其功效是清熱止利、和中緩急，用于濕熱下注所導致的痢疾，現代中醫臨床常用來治療下利熱痢等病證。或以此方加減治療各種感染性疾病，如熱瀉腹痛、急性腸炎、流行性腹瀉、急性菌痢、痢疾及病毒性肝炎等濕熱內盛病證。黃芩湯的抗炎解毒作用是黃芩、甘草配伍比例變化所產生的協同結果[1-4]。中藥方劑的最大特點就是按照一定的組方配伍規律應用于臨床，同樣中藥由于組方配伍比例不同，其主治和功效都會有所差別，根本原因在于其中藥的有效成分配伍比例關系發生了變化[5]，黃芩苷的溶出率，甘草酸的濃度，樣液表面張力都會隨配伍變化而改變。本實驗采用不同浸泡時間回流提取，考察一定比例黃芩-甘草對黃芩苷與甘草酸的溶出率、固含物的影響，同時研究在最佳浸泡時間的實驗參數下黃芩-甘草不同配伍比例對黃芩中黃芩苷溶出的影響[6-7]。

1 材料與儀器

1.1 材料

實驗用藥材飲片黃芩(江蘇徐州醫藥股份有限公司中藥飲片廠，批號為20161228)，炙甘草(江蘇徐州醫藥股份有限公司中藥飲片廠，批號為20161228)；黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為PS0912SB13)；甘草酸銨對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為1107311-201619)；乙腈、甲醇(美國Fisher公司，色譜純)；磷酸(國藥集團化學試劑有限責任公司，分析純)；純凈水(娃哈哈牌)；高純水(自制)。

1.2 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(安捷倫中國有限公司)；TGL-18C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；FA1204B萬分之一電子天平(上海精密科學有限公司)；CAP225D十萬分之一電子天平(德國賽多利斯)；BZF50型真空干燥箱(上海博訊)。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷與甘草酸的含量測定

2.1.1 色譜條件 (1)黃芩苷：Merck C18色譜柱(250 mm*4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水-磷酸(40∶60∶0.2)為流動相；柱溫：25 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

(2)甘草酸：MerckC18色譜柱(250 mm*4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.05%磷酸為流動相梯度洗脫，柱溫：25 ℃；檢測波長：240 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。梯度洗脫程序，見表1。

表1 甘草酸的梯度洗脫程序

2.1.2 對照品的制備 (1)黃芩苷對照品溶液的制備：取黃芩苷對照品適量，精密稱定5.20 mg，加甲醇定容于25 mL的容量瓶中，超聲溶解，當濃度為208 μg/mL，即為黃芩苷對照品溶液。

(2)甘草酸對照品溶液的制備：取甘草酸胺對照品適量，精密稱定3.50 mg，加70%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，超聲溶解，當濃度為137 μg/mL，即為甘草酸對照品溶液。

2.1.3 線性關系考察 精密稱量黃芩苷對照品、甘草酸銨對照品分別制成濃度為1.38 mg/mL、2.75 mg/mL、5.50 mg/mL、11.00 mg/mL、22.00 mg/mL的黃芩苷、甘草酸的標準品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，濾液在“2.1.1”色譜條件下，進行測定，以對照品質量濃度(mg/mL)對測得的峰面積進行線性回歸，繪制標準曲線。結果表明：甘草酸在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內，線性關系良好，其回歸方程為：y=2 430.7x+4.552(r=0.999 97)。黃芩苷在1.38～22.00 mg/mL濃度范圍內，線性關系良好，其回歸方程為：y=12 198x+159.58(r=0.999 99)。

2.2 不同浸泡時間對黃芩-甘草回流提取中各成分的影響

2.2.1 供試品的制備 稱取黃芩-甘草(3∶2)三份，用8倍量水，回流2次，每次回流1h，單因素考察最佳浸泡時間，分別按0 h、0.5 h、1.0 h浸泡，濾出，合并每次濾液，放置至室溫，離心樣品溶液，取上清液，備用分別編號為供試品溶液A、B、C。

2.2.2 黃芩苷、甘草酸溶出率及固含物測定 取供試品溶液A、B、C，過0.45 μm微孔濾膜，用高效液相測定(黃芩苷含量測定色譜圖，見圖1)，并計算提取液中黃芩苷、甘草酸的溶出率；精密稱取供試品A、B、C溶液50 mL，置于已經干燥至恒定質量的蒸發皿中，在電爐上蒸干，于105 ℃的烘箱內干燥3.5 h，置于干燥器內，冷卻30 min至室溫，精密稱定質量，并按照取樣體積與樣品總體積比例折算樣品固含物總量。結果見表2。

表2 不同浸泡時間黃芩苷、甘草酸溶出率及固含物結果

圖1 黃芩苷對照品(A)、供試品A(B)色譜

結果表明：浸泡0～1 h內，黃芩苷、甘草酸的溶出率、固含物的含量均隨著浸泡時間的增加逐漸降低，其中黃芩苷溶出率由97.376 mg/g下降至64.968 mg/g，甘草酸溶出率由3.382 mg/g下降至2.256 mg/g，固含物量由20.96%下降至16.88%，故在以下不同比例配伍實驗回流時，藥材無需浸泡。

2.3 黃芩-甘草不同配伍比例對黃芩苷的溶出影響

2.3.1 供試品制備 分別按黃芩-甘草配伍比例1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1稱取黃芩-甘草藥材飲片，加8倍量水，加熱回流2次，每次1 h，合并2次濾液，放置至室溫，離心樣品溶液，取上清液，備用。

2.3.2 黃芩苷、甘草酸含量測定 取在“2.3.1”項下制備的9組不同配伍比例供試品樣液，過0.45 μm微孔濾膜，濾液分別按“2.1.1”項下色譜條件，行高效液相測定，并計算9組樣液中甘草酸濃度、黃芩苷的溶出率和相對溶出率。結果見表3。

2.3.3 黃芩與甘草不同配伍比例表面張力測定 取“2.3.1”項下制得的9組供試品溶液采用wilhelmy吊片[8]測定表面張力，采用蓋玻片插入液體，使其底面與液面接觸，測定吊片脫離液體所需與表面張力抗衡的最大力(F)。結果見表3。

表3 不同配伍比例黃芩苷、甘草酸溶出率及表面張力實驗結果

結果表明：在黃芩-甘草配伍比例1∶1～1∶6時，黃芩苷溶出率隨著甘草比例的增大可以達到最大值。當黃芩-甘草配伍比例為3∶1時，甘草酸的濃度達0.193 mg/mL，黃芩苷的相對溶出率最大，溶出率為86%，表面張力最小，張力值為50.76 mN/m，故此時的甘草酸濃度是最佳的臨界膠束濃度。

3 討論

本研究結果顯示，隨著浸泡時間的延長，黃芩苷的溶出率、固含物的量均降低，可能因為自身的酶分解黃芩苷，而導致黃芩苷的溶出率降低，印證了《傷寒論》原文的煎煮方法(沒有提及浸泡)。在黃芩-甘草不同配伍比例實驗中，合提液中黃芩苷的相對溶出率隨著甘草濃度的增加而增大，提示黃芩苷的溶出與甘草酸在溶液中形成膠束有關。

甘草中的甘草酸具有表面活性劑的作用，當黃芩-甘草按不同比例配伍時，溶液的表面張力出現一個拐點，達到最小值50.76mN/m，此時為甘草酸最佳的臨界膠束濃度，形成膠束后使難溶性的黃芩苷在水溶液中的溶解度達到最大。通過測定，經典方黃芩湯(黃芩-甘草：3∶2)的相對溶出率略高于(黃芩-甘草：3∶1)的溶出率(86.06%)，由此證明黃芩湯經典藥對黃芩-甘草(3∶2)也是有科學依據的，但根據實驗結果，臨床使用時可以相對降低甘草的使用比例但不應低于3∶1，也可以達到較高的黃芩苷溶出率，并節省中藥材。

4 結語

黃芩與甘草作為經典藥對普遍應用于臨床，但若組方配伍比例不同，導致中藥的有效成分配伍比例關系發生了變化，其主治和功效都會有所差別。本實驗通過采取不同的浸泡時間、黃芩-甘草的不同配伍比例進行研究，以表面張力、相對溶出率為評價指標，最佳配伍比例為3∶1，此時表面張力最小，黃芩苷相對溶出率最大。