藥用昆蟲(chóng)九香蟲(chóng)總RNA提取方法篩選

陳緒美，尹志勇，鄭玉琳，檀 軍，田 瑩，郭建軍

(貴州大學(xué) 昆蟲(chóng)研究所 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

傳統(tǒng)中藥九香蟲(chóng)AspongopuschinensisDallas，1851是昆蟲(chóng)綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆蟲(chóng)，在貴州、云南、四川、廣西、廣東、臺(tái)灣、安徽等地均有該蟲(chóng)分布[1]。九香蟲(chóng)最早記載于《本草綱目》：“九香蟲(chóng)產(chǎn)于貴州永寧赤水河中……主治膈脘滯氣，脾腎虧損，壯元陽(yáng)”[2]，因其具有理氣止痛、溫中助陽(yáng)等功能而備受人們的重視[3]。現(xiàn)代醫(yī)藥研究表明，九香蟲(chóng)具有良好的抗癌功效，其可用于治療食管癌和胃癌等，對(duì)乳腺癌、子宮頸癌、喉癌也有一定的療效[4-6]。

九香蟲(chóng)含豐富的抗癌、抗菌、抗凝血等活性成分[3]，從九香蟲(chóng)中提取高質(zhì)量RNA是對(duì)其藥用活性物質(zhì)相關(guān)基因進(jìn)行深層次研究的重要基礎(chǔ)。然而，九香蟲(chóng)屬節(jié)肢動(dòng)物，體壁及腹腔中富含大量的幾丁質(zhì)、脂類、蛋白等物質(zhì)[7]，其對(duì)總RNA的提取質(zhì)量影響較大，進(jìn)而影響相關(guān)功能基因的克隆及表達(dá)分析，故篩選高效的總RNA提取方法將有利于九香蟲(chóng)的深層次開(kāi)發(fā)利用。

目前，分離提取總RNA的方法較多，如胍/熱酚法[8]、氯化胍法[9]、異硫氰酸胍法[10]、TRIzol法、CTAB 法、SOS-Phenol 法、酶解法等[11]，各生物公司也研發(fā)出多種RNA分離提取的試劑盒。但很多RNA提取方法常存在干擾RNA完整性、純度及濃度的各類酶和色素等物質(zhì)，直接或間接地影響RNA的提取質(zhì)量[12]。本研究采用3種RNA分離提取方法：TRIzol法、RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒法、HP Total RNA Kit試劑盒法進(jìn)行九香蟲(chóng)總RNA的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的九香蟲(chóng)總RNA的完整性、濃度、純度，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析比較，以期篩選到一種能夠獲得高質(zhì)量九香蟲(chóng)RNA的提取方法，為其后續(xù)功能基因篩選研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九香蟲(chóng)采自遵義習(xí)水(東經(jīng)106°22′、北緯22°32′)，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。焦碳酸二乙酯(DEPC)、75%乙醇、氯仿、異丙醇、2-巰基乙醇、無(wú)水乙醇，RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、HP Total RNA Kit試劑盒(OMEGA Bio-tek)。

1.2 RNA提取

1.2.1 TRIzol法 取185 mg九香蟲(chóng)于液氮充分研磨，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入600 μL TRIzol，振蕩30 s，室溫放置5 min；加入160 μL氯仿，振蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃，10 000 g 離心20 min；取上層無(wú)色水相于RNAse-free離心管中，于離心管加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置30 min；4 ℃，10 000 g 離心20 min，棄上清；加入600 μL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，10 000 g離心3 min，棄上清；室溫放置3 min，晾干，加入50 μL DEPC水，-80 ℃保存。

1.2.2 RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒法 取185 mg九香蟲(chóng)組織，置于液氮中研磨成粉末，立刻加入600 μL裂解液，輕輕吹打10次，室溫放置5 min；14 000 g離心2 min，取上清；加入等體積結(jié)合液，輕輕顛倒混勻5次，移至純化柱中，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物；加入600 μL洗滌液Ⅰ，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物；加入600 μL洗滌液Ⅱ，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物；再加入600 μL洗滌液Ⅱ，12 000 g離心30 s，棄離心產(chǎn)物，14 000 g離心2 min，去除殘留的液體；將RNA純化柱置于RNA洗脫管中，加入50 μL洗脫液，室溫放置3 min，14 000 g離心30 s；重復(fù)洗脫一次，-80 ℃保存。

1.2.3 HP Total RNA Kit試劑盒法 取185 mg九香蟲(chóng)組織于2 mL離心管中，加入500 μL Buffer GTC溶解；在室溫條件下，12 000 g離心5 min；轉(zhuǎn)移上清液至gDNA離心柱中，25 ℃，12 000 g離心2 min；加入250 μL無(wú)水乙醇，吹打混勻；向套有2 mL收集管的HiBind ? RNA Mini離心柱中加入500 μL樣本，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；加入300 μL RNA Wash BufferⅠ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；再加入400 μL RNA Wash BufferⅠ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；加入500 μL RNA Wash BufferⅡ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；再次向離心柱中加入500 μL RNA Wash BufferⅡ，25 ℃，10 000 g離心1 min，棄離心產(chǎn)物；加入30 μL的DEPC水，靜置2 min，10 000 g，離心1 min；重復(fù)洗脫一次，-80 ℃保存。

1.3 RNA檢測(cè)

1.3.1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 配制1% 瓊脂糖凝膠；取3 μL九香蟲(chóng)RNA和2 μL上樣緩沖液混合，上樣；1% 瓊脂糖凝膠中130 V電壓下電泳15或20 min，用Bio-Rad凝膠成像儀拍照。三次重復(fù)。

1.3.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè) 取九香蟲(chóng)RNA 1μL，用NanoDrop 2000/2000C分光光度計(jì)檢測(cè)九香蟲(chóng)總RNA 的濃度、OD260/280，并計(jì)算九香蟲(chóng)總RNA含量，九香蟲(chóng)總RNA含量=RNA濃度×RNA溶液體積/九香蟲(chóng)組織質(zhì)量。三次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)用TRIzol法和HP Total RNA Kit試劑盒法提取出的九香蟲(chóng)總RNA有兩條清晰可見(jiàn)的條帶，使用TRIzol法提取的九香蟲(chóng)總RNA電泳圖中28S條帶比18S條帶的亮度強(qiáng)，用HP Total RNA Kit試劑盒法提取獲得的九香蟲(chóng)總RNA的18S條帶比28S條帶的亮度強(qiáng)，而使用RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒法提取的RNA未見(jiàn)到清晰的條帶。

注：A：TRIzol法(電泳20 min)；B：RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒(電泳20 min)；C：HP Total RNA Kit試劑盒(電泳15 min)

圖1 三種方式提取九香蟲(chóng)總RNA電泳

2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，九香蟲(chóng)RNA的含量以TRIzol法提取的最高(432.856±54.560 ng/mg)，HP Total RNA Kit試劑盒法提取的次之(40.104±19.386 ng/mg)，RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒法提取的最低(12.879±1.051 ng/mg)；3種方法提取的九香蟲(chóng)RNA的OD260/280都在1.9～2.1，表明被蛋白質(zhì)和DNA等其他物質(zhì)污染較少[13]，其中，TRIzol法提取RNA的OD260/280為1.910±0.180，純度最高。

表1 3種方法提取九香蟲(chóng)RNA的含量、純度及耗時(shí)

綜合1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果可知，用TRIzol法提取獲得的九香蟲(chóng)RNA完整性、純度、濃度均最好。

3 討論

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、基因克隆和RT-PCR等實(shí)驗(yàn)均需要高質(zhì)量的RNA[14]，但RNA極容易降解，提取過(guò)程中存在的各種核糖核酸酶及理化因子都可能引起RNA的降解，從而影響后續(xù)的cDNA合成、基因克隆或表達(dá)分析[15-16]。理想的RNA提取方法應(yīng)能夠在復(fù)雜環(huán)境條件下從不同的樣本中提取到高質(zhì)量的RNA，本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象九香蟲(chóng)屬于昆蟲(chóng)綱半翅目兜蝽科昆蟲(chóng)，是《本草綱目》記載的一味傳統(tǒng)中藥，其體壁及腹腔中富含大量的幾丁質(zhì)、脂類、蛋白等物質(zhì)[7]，嚴(yán)重影響了RNA的提取質(zhì)量及相關(guān)功能基因克隆。因此，篩選合適的RNA提取方法對(duì)后續(xù)九香蟲(chóng)功能基因的克隆、表達(dá)等研究至關(guān)重要。

近年來(lái)，研究人員對(duì)提取昆蟲(chóng)總RNA的方法不斷進(jìn)行比較和優(yōu)化，王鵬等[17]在提取荒漠甲蟲(chóng)總RNA時(shí)比較了TRIzol、CTAB、熱酚法以及BioTeke Kit 和TianGen Kit 試劑盒法，發(fā)現(xiàn)TRIzol 法提取的總RNA的效率較另3種方法都高；徐文凱等[18]對(duì)TRIzol法優(yōu)化后對(duì)意大利蜜蜂的總RNA進(jìn)行了提取，得到了質(zhì)量高、完整性好的RNA；高陽(yáng)等[19]用改進(jìn)的硅粒吸附法和TRIzol法提取小型昆蟲(chóng)的總RNA。在眾多研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，TRIzol法是一種提取昆蟲(chóng)總RNA較常用且效果較好的方法。

本研究中的九香蟲(chóng)樣本均在相同條件下處理獲得，避免了樣本差異對(duì)提取結(jié)果帶來(lái)的影響。九香蟲(chóng)組織的研磨在離心管中用去酶小研磨棒研磨，此過(guò)程避免了在研磨過(guò)程中九香蟲(chóng)組織的損失及各種酶類對(duì)九香蟲(chóng)RNA的降解。TRIzol法提取RNA是較常規(guī)的一種方法，所用的實(shí)驗(yàn)試劑都是實(shí)驗(yàn)室里的常規(guī)試劑，價(jià)格都比較低廉，操作方法也比較簡(jiǎn)便。除了九香蟲(chóng)組織的研磨及離心沒(méi)有在生物安全柜里操作外，其余步驟均在生物安全柜中操作，這也是本次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)點(diǎn)之一。采用TRIzol法提取九香蟲(chóng)RNA耗時(shí)較長(zhǎng)(耗時(shí)約100 min)，RNAeasy動(dòng)物RNA抽提試劑盒法和HP Total RNA Kit試劑盒法較簡(jiǎn)便(耗時(shí)約40 min)，前者提取RNA的純度較高、濃度較低，但二者所提取的RNA完整性、濃度、純度均較TRIzol法差。

綜上所述，3種方法中TRIzol法提取九香蟲(chóng)RNA的完整性、純度、濃度最好，可為后續(xù)九香蟲(chóng)功能基因的克隆及基因表達(dá)分析提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。