龍眼肉水提物對小鼠抗疲勞及耐缺氧作用實(shí)驗(yàn)研究

郭超萍，張 兵，包傳紅*

(1.玉林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 玉林 537000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200)

疲勞在中醫(yī)學(xué)中屬于“虛”“虛損”“虛勞”等范疇，疲勞的病機(jī)主要是氣血失常和五臟的功能失調(diào)。李中梓提出《內(nèi)經(jīng)》所說的虛勞分為氣虛、血虛兩個(gè)方面。也就是由于大負(fù)荷量運(yùn)動能損耗機(jī)體精氣血津液和能量物質(zhì)，累及心肝脾腎等臟腑，導(dǎo)致運(yùn)動能力下降[1]。龍眼肉，為無患子科植物龍眼DimocarpuslonganLour.的假種皮[2]。具有補(bǔ)益心脾、養(yǎng)血安神之功效，常用于氣血不足、心悸怔忡、健忘失眠、血虛萎黃等癥的治療。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)龍眼肉具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3-4]、抗衰老[5]、抗癡呆[6]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[7]。龍眼肉既可以補(bǔ)益心脾之氣，又可以養(yǎng)心肝之血，符合中醫(yī)治療虛勞的理論，再結(jié)合疲勞的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激之間存在很大關(guān)系[8]的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)用龍眼肉水提物通過小鼠負(fù)重游泳和耐缺氧實(shí)驗(yàn)，檢測各項(xiàng)抗疲勞、抗氧化的指標(biāo)，探討龍眼肉水提物的抗疲勞和耐缺氧的作用機(jī)制，以期為其臨床用于虛證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號：SCXK：桂2013-0003。

1.2 藥品和試劑

龍眼肉(廣西柳州百草堂中藥飲片廠有限責(zé)任公司)；紅景天膠囊(北京同仁堂有限公司)；鈉石灰(上海五四化學(xué)試劑有限公司)；尿素氮試劑盒、肝糖元試劑盒、乳酸試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化歧化酶試劑盒和丙二醛試劑盒(武漢華美工程公司)。

1.3 儀器

游泳箱(50 cm×50 cm×40 cm)；電子分析天平(德國賽多利斯，型號：BSA224S)；高速離心機(jī)(Thermo Fisher，型號：ST16)；電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠，型號：HHS-8) ；全自動動物生化分析儀(美國拜譜有限公司，型號：Trilogy) ；鉛皮。

2 方法

2.1 藥物制備

取龍眼肉加入純水加熱提取3次，合并提取液，濃縮至0.45 g/mL。

2.2 動物分組與給藥

選取50只SPF級小鼠，隨機(jī)分為正常對照組、紅景天膠囊(600 mg·kg-1)和龍眼肉水提物高(9 g·kg-1)、中(4.5 g·kg-1)、低(2.25 g·kg-1)劑量組，每組10只。分別灌胃紅景天膠囊及龍眼肉水提物，正常對照組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，20 mL·kg-1，連續(xù)30 d。

2.3 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[9]

最后1次給藥后次日將小鼠置游泳箱(50 cm×50 cm×40 cm)中游泳。水溫(25±1)℃，水深不少于30 cm，小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮。以小鼠全身沒于水面以下，8 s內(nèi)不能浮出水面即為力竭，記錄開始游泳至力竭的時(shí)間，為力竭游泳時(shí)間。

2.4 小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)[10-11]

最后1次給藥后分別將小鼠放入盛有10 g鈉石灰的容量為250 mL磨口瓶內(nèi)，加上蓋子密封。觀察其存活時(shí)間，以呼吸停止為死亡指標(biāo)。

2.5 血清乳酸(BLA)和乳酸脫氫酶(LDH)測定

小鼠末次給藥30 min后采血，然后不負(fù)重在溫度為30 ℃的水中游泳10 min后停止，游泳后采血進(jìn)行LA和LDH測定。

2.6 血清尿素(BUN)測定

小鼠末次給藥30 min后，在溫度為30 ℃的水中游泳90 min，休息60 min后立即摘眼球采血，離心后吸取血清參照試劑盒說明書操作，于生化分析儀上測定血清BUN含量。

2.7 小鼠血清超氧化歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量測定

小鼠末次給藥30 min后，取血采用ELISA法檢測小鼠血清SOD含量和MDA含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間采用單因素方差分析，各組之間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠力竭游泳時(shí)間與耐缺氧時(shí)間測定結(jié)果

由表1可知，陽性對照組與各劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和耐缺氧時(shí)間均比正常對照組長；與正常對照組對比，陽性對照組及高劑量組有非常顯著性差異(P<0.01)，中劑量組有顯著性差異(P<0.05)，低劑量組與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)。對于耐缺氧時(shí)間，陽性對照組與各劑量組小鼠耐缺氧時(shí)間均比正常對照組長，陽性對照組及高劑量組與正常對照組對比，有非常顯著性差異(P<0.01)，與中及低劑量組相比有顯著性差異(P<0.05)。

組別劑量力竭游泳時(shí)間(min)耐缺氧時(shí)間(min)正常對照組-17.66±2.9029.13±3.50紅景天膠囊組600mg·kg-123.16±2.51??36.94±3.79??高劑量組9g·kg-121.63±2.52??34.16±3.46??中劑量組4.5g·kg-120.52±2.25?32.92±2.27?低劑量組2.25g·kg-118.58±2.2232.15±2.63?

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各組小鼠抗疲勞指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，陽性對照組與龍眼肉水提物各劑量組的尿素氮明顯低于正常對照組，但肝糖原含量顯著高于正常對照組。對于尿素氮，與正常對照組對比，陽性對照組及高劑量組有非常顯著性差異(P<0.01)，中劑量組有顯著性差異(P<0.05)；對于肝糖原，陽性對照組及高劑量組的肝糖原含量與正常對照組對比，有非常顯著性差異(P<0.05)，中劑量組有顯著性差異(P<0.05)，低劑量組的肝糖原含量與空白對照組相比無顯著性差異。

組別劑量尿素氮(mmol/L)肝糖原(mg/g)正常對照組-14.23±1.9210.92±2.13紅景天膠囊組600mg·kg-18.59±1.28??14.75±2.17??高劑量組9g·kg-19.97±1.02??13.81±2.27??中劑量組4.5g·kg-112.05±1.68?13.14±2.53?低劑量組2.25g·kg-112.47±1.4011.72±1.22

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

由表3可知，陽性對照組與龍眼肉水提物各劑量組游泳后乳酸的含量與正常對照組明顯降低，乳酸脫氫酶活力與正常對照組明顯升高。對于乳酸含量，與正常對照組對比，陽性對照組及高劑量組有非常顯著性差異(P<0.01)，中劑量有顯著性差異(P<0.05)；對于乳酸脫氫酶，陽性對照組及高劑量組的肝糖原含量與正常對照組對比，有非常顯著性差異(P<0.05)，中劑量組有顯著性差異(P<0.05)，低劑量組與正常對照組相比無顯著性差異。因此結(jié)果表明，龍眼肉水提物能提高LDH的活性，加快清除無氧糖酵解所生成的乳酸，從而減少乳酸在體內(nèi)堆積，延緩疲勞的產(chǎn)生或加速疲勞的消除。

組別劑量乳酸(mmol/L)乳酸脫氫酶(U/L)正常對照組-10.84±1.2010.62±1.54紅景天膠囊組600mg·kg-17.93±0.86??14.14±1.90??高劑量組9g·kg-19.12±1.05??13.09±1.72??中劑量組4.5g·kg-19.17±1.04??12.57±1.92?低劑量組2.25g·kg-110.05±1.3112.25±1.81

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 龍眼肉水提物對小鼠血清SOD、MDA含量的影響

由表4結(jié)果可知，紅景天膠囊組、龍眼肉水提物高、中劑量組的SOD含量明顯升高，與正常對照組比較有非常顯著性差異(P<0.05)，而龍眼肉水提物低劑量組無顯著性差異(P>0.05)。與正常對照組相比，西洋參口服液組、龍眼肉水提物高、中劑量組MDA水平明顯降低，有非常顯著性差異(P<0.01)，中劑量組MDA水平與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

組別劑量SOD(pg·mL-1)MDA(pmol /L)正常對照組-206.41±17.75??692.62±73.41紅景天膠囊組600mg·kg-1235.37±21.68??545.91±66.94??高劑量組9g·kg-1225.98±13.06?577.09±69.98??中劑量組4.5g·kg-1220.67±10.65?606.89±68.59?低劑量組2.25g·kg-1209.47±10.20608.16±759.49

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)和常壓缺氧實(shí)驗(yàn)可以反映在環(huán)境供氧缺乏和自身耗氧量增加的情況下，機(jī)體抗疲勞及耐缺氧的能力，因此常被用于研究藥物的抗疲勞和耐缺氧作用[11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龍眼肉水提物能明顯延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和小鼠在常壓缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間，說明龍眼肉水提物具有增強(qiáng)小鼠抗疲勞和耐缺氧的能力。在反映疲勞的生化指標(biāo)中，血清尿素氮、乳酸水平、肝糖原含量生化指標(biāo)的改變比較明顯，也是檢測疲勞最常用的指標(biāo)[13]。運(yùn)動后血清尿素氮的多少提示機(jī)體利用蛋白質(zhì)供能的多少，間接反映機(jī)體的疲勞程度，也是檢測疲勞的理想指標(biāo)[14]。糖原是運(yùn)動中最重要的能源物質(zhì)，機(jī)體劇烈運(yùn)動后大量糖原被消耗，因此糖原儲備可作為評價(jià)機(jī)體抗疲勞的另一重要指標(biāo)[15]。結(jié)果表明，龍眼肉水提物能降低運(yùn)動后血清尿素的增量，顯著增加運(yùn)動小鼠肝糖原的儲備。SOD是體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，它可以催化O2-歧化反應(yīng)生成H2O2。MDA作為一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它可以反映出組織氧化的程度水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示龍眼肉水提物能水平升高SOD的水平，減少M(fèi)DA的生成。

龍眼肉水提物抗疲勞的作用機(jī)制可能與其增加力竭游泳過程中肝糖原的儲備，降低代謝產(chǎn)物BUN、LA 及MDA的水平，提高 SOD及LDH活性，加速氧自由基的清除，增強(qiáng)了小鼠的抗氧化能力，從而減輕機(jī)體的氧化損傷，調(diào)節(jié)整個(gè)機(jī)體代謝狀態(tài)，最終提高小鼠的運(yùn)動能力，起到抗疲勞作用。