外源NO對鹽脅迫下紫花苜蓿生長及膜脂過氧化的影響

蔣文博，陳 釗，曹新龍，牛軍鵬，郭志鵬，崔 健，王佺珍

（1. 西北農林科技大學草業與草原學院，陜西 楊凌 712100；2. 西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100）

土壤鹽漬化是人類面臨的世界性問題，而鹽漬化土地也是我國重要的、具有潛在利用價值的邊際土地資源。我國鹽堿化土地總面積約為3 667萬hm2，其中鹽漬化耕地近670萬hm2，約占全國耕地面積的5%[1-3]。鹽脅迫是植物生長發育和產量形成的重要限制因素之一，鹽脅迫不僅會引起植物失水，還會造成離子毒害，導致營養失衡。在正常條件下，植物體內的離子能夠保持動態平衡，而在鹽脅迫下，Na+濃度過高會引起植物發生缺素現象，進而影響植物的營養吸收和生長[4]。Cheruth等[5]指出鹽生環境可通過對植物體內物質運輸及物質代謝途徑進行調控，從而達成對植物生長的抑制。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是優質的多年生豆科牧草，多在我國干旱、半干旱地區種植，這些地區同樣是我國土地鹽漬化的多發區域。土地鹽堿化嚴重影響著紫花苜蓿的生長、發育以及質量和產量。龍明秀等[6]研究證明當鹽濃度超過40 mmol·L-1后，紫花苜蓿抗性減弱，葉片MDA和H2O2含量顯著上升。王靜等[7]的研究表明，在150 mmol·L-1NaCl的脅迫下，約80%的紫花苜蓿植株下部的葉片出現褐斑或卷曲。Wang等[8]發現紫花苜蓿在200 mmol·L-1NaCl的脅迫下，幼苗、根的鮮重和長度均低于對照。Sandhu等[9]的研究表明，鹽脅迫抑制了紫花苜蓿的生物量和地上長度。此外，鹽脅迫可減小紫花苜蓿的光合葉面積，抑制凈光合速率和地上部分生物量的增長[10-11]，也可影響紫花苜蓿Na+、K+和Ca2+的分布，并增加脯氨酸的含量[12]。

NO是重要的氧化還原信號分子之一，廣泛分布于植物的各種組織，并在植物生長發育及鹽害、冷害、干旱和病原菌侵染等脅迫應答過程中起重要作用[13-14]。研究發現，用NO的外源供體SNP對紫花苜蓿進行引發處理能夠打破種子休眠，促進種子萌發[15]，并且用SNP浸過的種子萌發出土后的地上部分明顯高于未浸種的植株。NO可以提高紫花苜蓿在鹽脅迫下對硝態氮的利用效率，增強氮代謝酶的活性[16]；亦可緩解滲透脅迫對紫花苜蓿幼苗葉片光合效率的抑制作用[17]；周萬海等[18]的研究表明NO能減輕鹽脅迫下苜蓿根系生長所受抑制，并緩解氧化損傷。趙穎等[17]的研究表明，對滲透脅迫下的紫花苜蓿幼苗施加SNP能顯著緩解葉片葉綠素a及葉綠素b含量的下降，提高類胡蘿卜素含量，促進光合色素的合成，提高紫花苜蓿葉片的有效光合面積。

NO作為信號分子，在植物抗逆過程中具有重要的作用，目前雖然有對紫花苜蓿耐鹽性的相關研究，但外源NO對不同濃度鹽脅迫下紫花苜蓿生理特性的影響的研究較為缺乏。因此，本研究以中苜1號紫花苜蓿為材料，探究了在不同濃度的鹽脅迫下，外源NO對其生長及膜脂過氧化的影響，以期為改善鹽堿地紫花苜蓿的生長提供理論基礎和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年4月-6月在陜西省咸陽市楊凌區西北農林科技大學北校區實驗溫室內進行。供試材料為中苜1號，本研究采用花盆培養，所用石英砂由0.425～0.850 mm、0.212～0.425 mm按1∶2比例混合所得。挑選飽滿、均勻的種子，用蒸餾水沖洗3～5次，隨后用20%次氯酸鈉消毒10 min，并用蒸餾水沖洗3～5次，最后用50 ℃溫水浸種引發1 h，每盆播種50粒，共60盆。生長期間定期澆灌1/2 Hoagland營養液。50 d后，開始進行鹽脅迫和外源NO處理。

1.2 試驗設計

根據北方鹽堿地的鹽分組成特點，選定NaCl、Na2SO4兩種中性鹽，按一價陰離子與二價陰離子之比2∶1將兩種鹽混合，設置24、72和120 mmol·L-13個鹽濃度(表1)。每盆苜蓿記作一個重復，每組隨機取3個重復。以硝普鈉(SNP)作為外源NO供體，SNP濃度分別為0.05、0.1、0.2和0.3 mmol·L-1(分別記作 N1、N2、N3和 N4)，以蒸餾水為對照(N0)。分別在第51、53、55和57 天進行鹽脅迫處理，每盆每次澆灌200 mL鹽溶液；SNP處理與鹽處理間隔1 d交替進行，即第52、54、56和58天施加SNP，處理時于根部澆灌200 mL，同時用噴壺于葉面噴施至有均勻水珠滴落。試驗設置空白對照(CK)，即不做鹽處理和SNP處理。處理結束5 d后對地上部分取樣，測定各項指標。

表1 試驗處理成分表Table 1 Compositions of the different treatments

1.3 測定方法

1.3.1 幼苗鮮干重的測定

取地上樣品，用蒸餾水沖洗，用吸水紙吸凈表面水分測量鮮重；隨后于105 ℃殺青30 min，70 ℃烘至恒重，稱量測得干重[16]。

1.3.2 幼苗葉綠素的測定

紫花苜蓿植株葉綠素a含量(Ca)、葉綠素b含量(Cb)、類胡蘿卜素含量(Cx)和總葉綠素含量(Ct)參照Rekik等[19]的方法，利用95%乙醇研磨、提取和測定。

1.3.3 相對電導率的測定

隨機選取5株苜蓿，利用直徑為1 cm的打孔器在同一位點打取10個小圓片，去離子水沖洗3次，在裝有10 mL去離子水的試管中將葉片抽真空，并在室溫下震蕩、放置20 min，測定電導率，記作A1；對試管進行持續5 min的沸水浴后靜置，待冷卻之后測定電導率，記作A2。相對電導率 = A1/A2× 100%[18]。

1.3.4 丙二醛 (MDA)含量的測定

利用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[20]。稱取0.3 g樣品，加2 mL 10% TCA和適量石英砂研磨，再用3 mL TCA沖洗轉入試管，低溫(4 ℃)下離心10 min(10 000 g)后，保存并記錄上清液體積。取上清液2 mL(TCA為對照)，加入5 mL 0.5% TBA后，及時沸水浴10 min，取出于20 ℃水浴中冷卻5 min，取上清液分別于450、532和600 nm波長下測定吸光值，并按以下公式計算結果。

MDA 含 量 = [6.45 × (OD532- OD600) - 0.56 ×OD450] × V1/(V × M)。

式中：V1，測定所用提取液的體積(mL）；V，提取液總體積(mL)；M，樣品重量(g)；FW，鮮重。

1.3.5 H2O2含量的測定

參照李合生[20]的方法，稱取葉片0.3 g，加3 mL 0.1% (W∶V)TCA冰浴研磨，并用2 mL TCA沖洗定容至5 mL，于4 ℃下離心10 min(12 000 g)。取上清液 1.0 mL(對照 1.0 mL 緩沖液)，與 0.5 mL 0.1 mol·L-1pH 7.0磷酸鉀緩沖液，1 mL 1 mol·L-1KI溶液混合，于室溫黑暗下靜置1 h后，測定390 nm處吸光度。H2O2含量通過標準曲線計算。

1.3.6 AsA含量及SOD、CAT和POD活性的測定

AsA含量的測定參照Kampfenkel等[21]的方法；SOD活性的測定參照Prochazkova等[22]的方法，并稍作改進；CAT活性的測定參照Cakmak等[23]方法，并稍作改動；POD活性的測定參照Cakmak等[23]。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0進行數據統計和分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan法進行多重比較和顯著性差異分析 (α = 0.05)。采用 GraphPad Prism 7.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 外源NO對鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

2.1.1 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

24 mmol·L-1低鹽脅迫下，紫花苜蓿植株的鮮重與干重顯著降低(P ＜ 0.05)，噴施SNP溶液能夠緩解鮮重、干重所受的抑制，其中N1、N2和N3處理組的鮮重和干重值均超過了CK (圖1)。在一定SNP濃度范圍內，植株干重和鮮重均隨著SNP濃度的升高而上升，干重在0.1 (N2)和鮮重在0.2 mmol·L-1(N3)達到最大值；繼續增大SNP濃度，紫花苜蓿的干重和鮮重反而會有所降低，當SNP濃度升至0.3 mmol·L-1(N4)后，植株鮮重顯著低于 N0(P ＜ 0.05)，這說明此種條件下SNP對植物產生了毒害作用。

圖1 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響Figure 1 Effects of exogenous NO on the dry weights and fresh weight of alfalfa under a low salt concentration

2.1.2 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

中等鹽脅迫水平(72 mmol·L-1)的紫花苜蓿干、鮮重的變化(圖2)的結果表明，鹽脅迫下紫花苜蓿的干重和險種均較對CK受到了明顯的抑制(P ＜0.05)，而噴施SNP的處理組干重均顯著高于鹽脅迫的N0組(P ＜ 0.05)。與低鹽脅迫濃度相比，干重和鮮重的最適SNP濃度同時提高至0.3 mmol·L-1(N4)，由此可知，隨著鹽脅迫的增強，紫花苜蓿所需外源NO最適濃度也隨之加大。

2.1.3 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

由圖3可知，120 mmol·L-1鹽濃度脅迫下，紫花苜蓿干、鮮重的變化規律與72 mmol·L-1鹽脅迫下相似，干、鮮重與CK相比受到了明顯的抑制(P ＜ 0.05)，且隨著SNP濃度的升高持續上升。施用 0.3 mmol·L-1(N4)的外源 NO處理組與脅迫組(N0)相比，紫花苜蓿的干重增加了1.351 g，鮮重增加了4.246 g，起到了最大促進效果。N4處理組的干重、鮮重均顯著高于處于正常生境下的植株(CK) (P ＜ 0.05)，表明噴施SNP不但緩解了鹽脅迫的抑制作用而且大幅促進了紫花苜蓿的生長。

圖2 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響Figure 2 Effects of exogenous NO on the fresh weights, and dry weight of alfalfa under a medium salt concentration

圖3 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響Figure 3 Effects of exogenous NO on the fresh weights, and dry weight of alfalfa under a high salt concentration

2.2 外源NO對鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

2.2.1 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

經24 mmol·L-1的鹽脅迫處理后，紫花苜蓿葉片中Ca、Cb、Cx和Ct的含量受到了顯著抑制(P ＜ 0.05) (圖 4、圖 5)。而當施用 SNP后，5項指標均有顯著回升，表明葉片所受的鹽脅迫得到了緩解(P ＜ 0.05)。升高SNP濃度，上述指標有所下降，存在高濃度SNP促進作用低于低濃度SNP的情況，并且5項指標呈現先增高后降低的規律。

2.2.2 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

72 mmol·L-1的鹽脅迫濃度下，純鹽脅迫組(N0)與 CK相比，Ca、Cb、Cx和 Ct分別降低了44.88%、 28.76%、 52.31%和 39.57%(圖 6、 圖 7)。施加SNP后，Ca、Cb、Cx和Ct較N0處理組顯著升高(P ＜ 0.05)。中等鹽脅迫下，N4處理組較脅迫組Ca/Cb含量顯著提高(P ＜ 0.05)。

2.2.3 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

鹽脅迫濃度增大至 120 mmol·L-1，Ca、Cb、Cx、Ct的最適SNP濃度分別為N4、N1、N1和N1(圖8、圖9)。高鹽脅迫下，N1對Cx的促進效果最為明顯(P ＜ 0.05)，其 Cx 含量提高至 0.001 538 mg·g-1FW，較脅迫組(N0)提高了98%。

2.3 外源NO對鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、H2O2和MDA含量的影響

2.3.1 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、H2O2和MDA含量的影響

圖4 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量的影響Figure 4 Effects of exogenous NO on the chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids contents in alfalfa under low salt concentration

圖5 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿總葉綠素含量和葉綠素a/b的影響Figure 5 Effects of exogenous NO on the chlorophyll contents and chlorophylla/b in alfalfa under low salt concentration

圖6 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量的影響Figure 6 Effects of exogenous NO on the chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids contents in alfalfa under medium salt concentration

24 mmol·L-1鹽濃度下，紫花苜蓿葉片相對電導率達35.67%，相比于CK顯著升高(P ＜ 0.05) (圖10)。外源施加SNP均能緩解鹽脅迫帶來的葉片損傷，降低相對電導率(P ＜ 0.05)。低鹽脅迫下，脅迫組植物葉片過氧化氫含量較CK組顯著升高(P ＜ 0.05)，升高16.42%。與脅迫組相比，SNP均顯著降低了植物葉片的過氧化氫含量，其中0.05、0.1 mmol·L-1濃度下的過氧化氫含量較低。此外，脅迫條件下，紫花苜蓿葉片MDA含量較CK組有顯著增加，增加了14.31%。與脅迫組相(N0)比，除0.3 mmol·L-1SNP處理組，葉片MDA含量均顯著降低，其中0.1 mmol·L-1SNP處理下葉片MDA含量最低。隨著SNP濃度的增加，SNP對鹽脅迫引起相對電導率、過氧化氫含量、MDA含量升高的緩解效果呈現先強后弱的趨勢。

2.3.2 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、H2O2和MDA含量的影響

圖7 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿總葉綠素含量和葉綠素ab比值的影響Figure 7 Effects of exogenous NO on the chlorophyll contents and Ca/Cb in alfalfa under medium salt concentration

圖8 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量的影響Figure 8 Effects of exogenous NO on the chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids contents in alfalfa under high salt concentration

圖9 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿總葉綠素含量和葉綠素a/b的影響Figure 9 Effects of exogenous NO on the chlorophyll contents and chlorophyll a/b in alfalfa under high salt concentration

提高鹽脅迫濃度至72 mmol·L-1，植物葉片相對電導率較CK組顯著升高(P ＜ 0.05)，增加到37.66%(圖11)；施加外源NO，所有NO處理組的相對電導率均顯著降低 (P ＜ 0.05)，0.05、0.1、0.3 mmol·L-1SNP處理組的相對電導率與CK組差異不顯著(P ＞0.05)。提高外源NO濃度至0.2 mmol·L-1，葉片相對電導率與CK組相比呈現顯著降低(P ＜ 0.05)，降至19.03%。N0下，過氧化氫含量與CK相比顯著增加(P ＜ 0.05)，增加了17.21%。施加外源NO，所有處理組的過氧化氫含量較脅迫組（N0)顯著降低(P ＜ 0.05)。N0下，MDA含量比CK組顯著升高，升高了23.61%；N1、N2、N3、N4處理組與N0相比能夠顯著降低MDA含量，分別降低了9.09%、21.92%、36.58%、25.80%。隨著 SNP濃度的增加，外源NO對鹽脅迫下葉片損傷帶來的相對電導率、過氧化氫含量、MDA含量的變化的緩解效果由強變弱。

圖10 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、MDA和H2O2 的影響Figure 10 Effects of exogenous NO on the relative electrical conductivity, MDA and H2O2 contents in alfalfa under low salt concentration

圖11 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、MDA和H2O2 的影響Figure 11 Effects of exogenous NO on the relative electrical conductivity, MDA, and H2O2 contents in alfalfa under medium salt concentration

2.3.3 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、H2O2和MDA含量的影響

120 mmol·L-1鹽脅迫濃度下，N0處理組的相對電導率與CK相比顯著增加，由22.94%增加到38.86%，外源施加NO后，N1、N2、N3、N4處理組與脅迫組N0相比均顯著降低，分別降至28.27%、23.27%、16.95%、20.53% (圖12)。此脅迫濃度下，植物葉片中過氧化氫含量與CK相比，顯著增高，增加了25.12%。N1、N2、N3、N4處理組過氧化氫含量與N0相比均顯著降低(P ＜ 0.05)，其中N3、N4處理較CK含量顯著降低，分別降低了47.48%和24.60%。此外，高鹽脅迫下，植物葉片中MDA含量較CK顯著增加，增加了69.62%，同時施加外源NO的N1、N2、N3、N4處理組與N0脅迫組相比均顯著降低，分別降低了27.25%、40.11%、56.38%、47.17%。可見，高鹽脅迫條件下，葉片相對電導率和過氧化氫含量會隨著SNP濃度的增加呈現先降后增的趨勢，而葉片MDA含量卻隨著SNP濃度的增加，呈現下降的趨勢。

2.4 外源NO對鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的影響

2.4.1 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的影響

當脅迫濃度為24 mmol·L-1時，紫花苜蓿葉片的SOD、CAT活性受到了顯著抑制(P ＜ 0.05)，POD活性有了顯著提升(P ＜ 0.05)，AsA含量也存在一定的下降(圖13)；對比施用外源NO處理組，結果顯示，施加NO對4種指標均產生了顯著的促進作用(P ＜ 0.05)。N2組的SOD活性最強，與 N0相比提升了61.77% (P ＜ 0.05)；POD與CAT的活性的最大活性值出現于N3處理組。此鹽脅迫濃度下，所有外源NO處理組的AsA含量均超過了CK，最高含量在N2處理組，其AsA含量與CK和N0相比分別增加61.28%和70.39% (P ＜ 0.05)。可見，4個指標均存在隨著SNP濃度的提高而先升高后降低的規律。

圖12 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對電導率、MDA和H2O2 的影響Figure 12 Effects of exogenous NO on the relative electrical conductivity, MDA, and H2O2 contents in alfalfa under high salt concentration

圖13 外源NO對低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和AsA含量的影響Figure 13 Effects of exogenous NO on the antioxidant enzyme activities and AsA content of alfalfa under low salt concentration

2.4.2 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的影響

72 mmol·L-1鹽脅迫下，外源NO施用組與單純脅迫對照組(N0)相比SOD、POD、CAT、AsA4種指標均有了一定的提高(圖14)。施用NO處理后的SOD活性得到了顯著提升(P ＜ 0.05)，N2處理組的SOD活性達到了最大值。中等鹽脅濃度下，N3處理組AsA含量達到最高值，較脅迫組與對照組有顯著提升(P ＜ 0.05)。隨外源NO濃度升高，SOD活性和AsA含量呈現先升高后降低的趨勢，而POD活性持續升高，并未出現降低的情況。

2.4.3 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的影響

圖14 外源NO對中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和AsA含量的影響Figure 14 Effects of exogenous NO on the antioxidant enzyme activities and AsA content of alfalfa under medium salt concentration

當鹽脅迫濃度提高至120 mmol·L-1，植株噴施SNP的所有處理組與N0相比(圖15)，依然能夠對4種生理指標大部分產生顯著的促進作用(P ＜ 0.05)，特別是N4處理與脅迫組間的差異最顯著，其中植株的SOD、POD和CAT活性分別提高了48.22%、107.34%和51.42%。此外，AsA含量隨著SNP濃度的升高持續上升，N1的AsA含量與N0組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。SOD、POD和CAT的活性隨著SNP濃度升高而持續增高。高濃度鹽脅迫(120 mmol·L-1)下，上述4種指標的最有效SNP濃度均為0.3 mmol·L-1(N4)。

3 討論

植物鮮、干重的波動反映了植物生物量的變化，SNP顯著緩解了鹽脅迫對紫花苜蓿鮮、干重的抑制作用，表明外源NO能夠提高紫花苜蓿抗鹽脅迫的能力，有利于保障紫花苜蓿的產量，72和120 mmol·L-1鹽脅迫下施用 0.3 mmol·L-1的 SNP 使紫花苜蓿的鮮重、干重同時達到了最高值，說明此兩種鹽脅迫下0.3 mmol·L-1SNP對紫花苜蓿產量促進能力最強。低濃度鹽脅迫時0.3 mmol·L-1的SNP降低了紫花苜蓿的鮮重(P ＜ 0.05)，這證明了外源NO作用的兩重性，此種鹽脅迫下最適SNP濃度介于0.1和0.2 mmol·L-1之間。土壤鹽脅迫會破壞植物葉綠體的結構，并且激活植物內葉綠體酶的活性，造成葉綠體的加速分解，進而導致植物葉綠素含量降低[24]。類胡蘿卜素既可作為光和色素，吸收傳遞光能；又可作為植物細胞的內源氧化劑，吸收多余光能，防止發生細胞膜脂過氧化[17]。在本研究中，施加SNP后葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，以及葉綠素a/b的值均顯著升高(P ＜ 0.05)，這表明外源NO能夠維持紫花苜蓿葉片的光合色素含量，為鹽脅迫環境下的光合作用提供保障，為植株正常生理生化活動提供能量基礎。具體原因可能是施加SNP提高了植物內NO含量，其作為信號分子，激活了葉綠素合成過程中的相關酶活性，或是提高與葉綠素結構相關的礦物質元素如Mg等的吸收效率。低鹽濃度脅迫時，SNP對Ca、Cx和葉綠素a/b的促進作用隨SNP濃度的升高而先增強后減弱，說明外源NO對紫花苜蓿的促進作用具有雙重性，并且紫花苜蓿對SNP的敏感度隨著鹽脅迫濃度的增加而降低。

圖15 外源NO對高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和AsA含量的影響Figure 15 Effects of exogenous NO on the antioxidant enzyme activities and AsA content of alfalfa under high salt concentration

在正常生長條件下，細胞膜對胞內外物質具有選擇透過性，當植物受到鹽漬、高溫、干旱等逆境脅迫影響時，會致使細胞膜的通透性會增大，胞內電解質外滲最終會導致植物細胞的相對電導率增大，其增大程度與脅迫強度和植物抗逆能力的強弱緊密相關。在本研究中，4種濃度的SNP均能顯著降低葉片的相對電導率(P ＜ 0.05)，但隨著SNP濃度的提高，其葉片電導率并未持續降低，而是呈先降后升的趨勢，這與焦娟等[25]試驗中0.1和0.2 mmol·L-1SNP能夠增強黃瓜(Cucumis sativus)幼苗抗氧化能力而0.3 mmol·L-1SNP抑制幼苗抗氧化能力的結果一致。不同的是，0.3 mmol·L-1SNP對紫花苜蓿抗氧化能力的促進作用減弱，并未達到抑制生長的程度，此種差異可能是兩種植物對SNP的敏感程度不同所造成的。

在鹽脅迫條件下，植物會大量累積H2O2，且對胞內的蛋白質、核酸等生物大分子起氧化作用，加速細胞的衰老、死亡[26]。MDA是脂質過氧化的主要產物，會對植物細胞產生氧化脅迫并導致膜系統損傷，造成嚴重的氧化傷害，因此，MDA和H2O2含量的高低可直接反映脂質過氧化的程度，常用作判斷脅迫損傷程度的指標。在本研究中，鹽脅迫處理導致苜蓿葉片發生氧化脅迫使得MDA和H2O2顯著升高和過量積累，從而影響其正常生長。SNP能夠顯著降低葉片中MDA和H2O2的積累，減弱鹽脅迫造成的氧化傷害，從而改善紫花苜蓿的生長。

在逆境脅迫下，植物體內存在著由SOD、CAT和POD等抗氧化酶及AsA等抗氧化物質組成的ROS清除系統，可抵御膜脂氧化損傷，保護植物。馬巧利等[24]研究表明NO能夠激活Cd脅迫下CAT和APX的活性，提高SOD和POD的活性，升高蛋白質和谷胱甘肽的表達量[27]，從而提高ROS的清除效率[17]。植物體內的AsA可被氧化為不穩定的單脫氫抗壞血酸(MDHA)，后經非酶促歧化反應生成 DHA[28]。在本研究中，鹽脅迫下的紫花苜蓿葉片SOD活性受到了顯著抑制，而施加SNP使其活性得到顯著提高，增強了ROS的清除效率。在清除H2O2的過程中，SOD、CAT與POD起協同作用，3種酶共同保護植物免受過氧化作用的損傷。CAT的活性變化與SOD相似。POD活性在植物遭受鹽脅迫后升高，說明POD能夠減弱脅迫所造成的活性氧損傷，而施加SNP進一步提高了SOD的活性同時，也對AsA有顯著的提高作用。這一系列變化促進了ROS的清除過程，說明外源NO能夠增強葉片中抗氧化系統中酶的活性和非酶物質的含量，以清除過量的ROS，從而緩解氧化傷害，增強紫花苜蓿對鹽脅迫的抗性。

外源NO對植物生長的作用存在低濃度促進、高濃度抑制的現象，低濃度NO可以增強抗氧化酶的活性，提高植物對ROS的清除效率，進而增強植物的抗逆性；而高濃度的NO可與超氧陰離子相互作用生成過氧亞硝酸根陰離子，進而形成具生物毒性的過氧亞硝酸[29]。本研究所用不同濃度的SNP(0.05、0.1、0.2 和 0.3 mmol·L-1)對鹽脅迫下的紫花苜蓿能夠起到緩解脅迫傷害、促進生長的作用，但本研究也存在高濃度SNP促進效果不如低濃度的現象，甚至對植物產生毒害作用。不同強度鹽脅迫下紫花苜蓿對外源NO的敏感度不同，此種差異可能與所受脅迫的強度和品種有關，也可能與處理濃度和時間有關[30-32]。相同濃度的SNP對不同鹽濃度脅迫損傷的緩解能力有所不同，在多數情況下，其對低濃度鹽脅迫損傷的修復能力更強，并且表現出雙重性，即隨著SNP濃度的升高，其對紫花苜蓿生長的促進作用呈先增后減的趨勢。隨著鹽濃度的升高，紫花苜蓿對SNP的敏感性下降，最適SNP濃度隨之升高。

4 結論

1)在不同濃度鹽脅迫下，外源NO可通過增強抗氧化系統中SOD、CAT和POD的活性及AsA的含量，從而緩解氧化損傷，促進中苜1號的生長，提高其鮮、干重。

2)外源NO對紫花苜蓿鹽脅迫損傷的緩解作用具有雙重性，其緩解能力隨著濃度的升高而先增強后減弱，且當濃度過高時呈現毒害作用。

3)紫花苜蓿所處的鹽脅迫強度越高，其對外源NO的敏感性越低，所需施用的最適SNP濃度也越高。

4)本研究中 24、72、120 mmol·L-1鹽脅迫下紫花苜蓿對應的最適SNP濃度分別為0.1、0.3和0.3 mmol·L-1。