炭疽病對春箭筈豌豆生長和生理生化的影響

丁婷婷，王曉瑜，聶 斌，張偉珍，段廷玉

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室 / 蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室 /蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020）

箭筈豌豆(Vicia sativa)是一類具有較高飼用價值和經濟價值的一年生豆科牧草，在我國分布較廣，甘肅、臺灣、陜西、青海等省份均有種植[1-2]。其生長較快，蛋白質含量高，適口性好，易被家畜消化[3-4]，被廣泛用作飼料、干草等[5]。此外，其適應性較強，具有固氮作用、綠化作用，并能夠改良土壤結構，是重要的綠肥作物[6]。

“蘭箭”系列箭筈豌豆是針對我國青藏高原為主體的高山草地農業系統，選育的早熟、優質、高產的箭筈豌豆新品種[7-8]，箭筈豌豆單作、燕麥-箭筈豌豆混播及箭筈豌豆復種是高山草原地區主要的栽培草地類型[9-10]，在當地畜牧業生產、農牧民增收、土地改良中發揮著重要作用。隨著箭筈豌豆的廣泛種植，限制其生產的因素也逐漸受到重視，其中主要的病原真菌引發的病害與牧草生產緊密相關[2]。截止2015年年底，世界范圍內已有報道的箭筈豌豆真菌病害共有14種，分布于28個國家或地區，其中莖葉部病害10種(黑腐病、炭疽病等)[2]。箭筈豌豆炭疽病是引起箭筈豌豆品質下降和產量減少的主要原因，該病是由刺盤孢屬(Colletotrichum)病菌引致[11]，葉片染病后病斑呈圓形或橢圓形，邊緣深褐色，中間暗綠色或淺褐色，嚴重時病斑融合至葉片枯死[12]。早在1919年，Naumov[13]就報道真菌可引致箭筈豌豆病害，但直到1934年，Dearness[14]和Weimer[15]才在箭筈豌豆上發現炭疽病，1959年Sawada[16]在我國臺灣發現并報道了由Colletotrichum viciae-sativae引致的此病害。蘭州大學草地保護學團隊在甘肅慶陽黃土高原試驗站對箭筈豌豆病害的研究發現，該病害2012 - 2014連續3年暴發流行，造成嚴重的產量損失[11]，并在2015年發現此病害由新病原菌小扁豆刺盤孢(Colletotrichum lentis)引起，并在國際上首次報道[17]，此病原菌在田間主要是無性繁殖[18]，發病迅速，容易在短時間內造成重大損失。

目前國內有關刺盤孢屬引起的炭疽病的研究主要集中于油茶(Camellia oleifera)[19-20]、蘋果(Malus pumila)[21]、柑橘(Citrus reticulata)[22]等經濟類作物，但常見牧草如箭筈豌豆、紫花苜蓿(Medicago sativa )、三葉草(Galium odoratum)、野豌豆(Vicia sepium)等均可感染此病害[23]，但尚未見牧草感染此病害的深入研究。尤其是國內外有關箭筈豌豆炭疽病的相關研究主要集中于病原菌菌落的形態、遺傳機制、致病性等[11,17,24]，病害對植物生長及生理生化的影響機制還不明確，亟需開展相關研究，明確病害對植物的影響，據此研發相應的防控技術。

根瘤菌(Rhizobium)可與豆科植物共生形成根瘤，是一類可將空氣中的氮氣固定的桿狀細菌，可與病原菌共同寄生在植物內。病原菌會限制根瘤菌的轉移，改變根瘤形態、宿主生長調節物質，產生病原代謝產物，從而限制根瘤形成和根瘤的正常功能[25-27]。病原菌對宿主植物的生長、根瘤及相關抗病酶均有影響，但對相關生理生化機制及基因調控的研究主要集中在根腐病、灰斑病等病害[2]。因此，本研究以蘭箭3號春箭筈豌豆為供試植物，設置不同根瘤菌、病原菌處理，旨在通過溫室試驗探究小扁豆刺盤孢對植物生長、根瘤及對抗病相關酶影響的生理生化機制，為進一步研究該病害，制定防控策略提供基礎資料。

1 材料及方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

供試植物為蘭箭3號春箭筈豌豆(V. sativa‘Lanjian No.3’)，由蘭州大學 2010年選育成功，是當前我國高寒地區種植的主要箭筈豌豆品種。播種前先用75%酒精消毒1 min，再用0.3%次氯酸鈉溶液消毒3 min，無菌水沖洗干凈。

1.1.2 根瘤菌

試驗菌株J3，由甘肅農業大學草業學院姚拓教授提供。接種于酵母菌-甘露醇液體培養基，28 ℃恒溫震蕩7 d培養至對數生長期。

1.1.3 病原菌

病原菌為小扁豆刺盤孢(Colletotrichum lentis)，由田間采集發病葉片分離純化所得。

1.1.4 供試土壤

草炭土于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌2 h；河砂過2 mm篩后，置于180 ℃烘箱中滅菌24 h。將兩者按草炭土∶河砂 = 2∶3的比例充分混合，密封備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種方法

盆栽試驗于2017年9月至12月，在蘭州大學草地農業科技學院智能溫室進行。試驗設置1種病原菌接種處理和1種根瘤菌接種處理，共4種處理：不接病菌和根瘤菌處理，記作R-F-；單接病原菌處理，記作R-F+；單接根瘤菌處理，記作R+F-；雙接菌處理，記作R+F+。每種處理共設5個重復，每個重復種植1盆，共20盆蘭箭3號春箭筈豌豆，隨機擺放。出苗1周后，挑選長勢相同的植株保留4株，隔日稱重、澆水保持田間最大持水量的60%。1)根瘤菌接種方法：將根瘤菌接種于酵母菌-甘露醇液態培養基中，28 ℃恒溫震蕩7 d得到根瘤菌菌液。將消毒后的種子用適量菌液浸泡30 min，將種子用干熱滅菌的黃土包裹。播種時每盆加入20 mL根瘤菌菌液。未接種根瘤菌的種子和土壤用無菌水代替孢子懸浮液做相同處理。2)病原菌接種方法：箭筈豌豆播種37 d后，接種病原菌。將在PDA (potato dextrose agar)平板培養基分離純化所得病原菌擴繁后，用手術刀刮取菌落到無菌水中，并用無菌水沖洗培養基。所得菌液充分混勻后用3層紗布過濾。采用血球計數板法對原始孢子懸浮液進行鏡檢計數，將原液稀釋一定倍數，并確保孢子量大于1 × 109CFU·mL-1。將植物葉片和莖稈用注射器造成創傷后，用刷子蘸取孢子懸浮液均勻涂抹在葉片上。用黑色塑料袋遮光48 h，并控制植物周圍濕度大于70%。未接種病原菌的植物用無菌水代替孢子懸浮液做相同處理。

1.2.2 測定指標

發病情況：在接種豌豆炭疽病后第9天統計，按葉片發病的程度記錄病情指數。0級：無癥狀；1級：葉片病斑面積小于葉片總面積的5%；2級：葉片病斑面積為葉片總面積的6%～20%；3級：葉片病斑面積為葉片總面積的21%～50%；4級：葉片病斑面積大于葉片總面積的51%～75%；5級：葉片病斑面積大于75%。

生物量的測定是將植物樣置于105 ℃烘箱中殺青30 min，75 ℃烘箱中烘干48 h后測定；根瘤數肉眼計數(直徑大于1 mm的粉色有活性根瘤)[28]。每盆分別取0.1 g新鮮葉片加9 mL PBS緩沖液研磨，4 500 r·min-1冷凍離心15 min制取酶提取液。過氧化物酶(POD)測定參照Millanes等[29]的方法；木質素測定參照Abiven等[30]的方法；茉莉酸(JA)測定用液相色譜法[31]；多聚半乳糖醛酸酶(PG)測定參照曹建康等[32]的方法；果膠甲基酯酶(PE)提取及測定參照Alonso等[33]的方法。

1.2.3 試驗數據統計

試驗數據按照不同接菌處理，用EXCEL 2016整理匯總，用JMP IN 4統計軟件進行方差分析，結果用GraphPad Prism 5.01作柱狀圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 接種病原菌對根瘤數及病情指數的影響

接種根瘤菌植物有效根瘤數，顯著高于不接菌處理(P ＜ 0.05) (圖1)。小扁豆刺盤孢顯著降低接種根瘤菌植物的有效根瘤數，R+F+處理較R+F-處理根瘤數降低 42.25% (P ＜ 0.05) (圖 1)。

圖1 不同處理下有效根瘤數以及植物病情指數Figure 1 Effective nodule number and disease index for different treatments

未接種病原菌的植株未出現發病癥狀，R+F+處理與R-F+處理相比植物病情指數降低42.73% (P ＜0.05)，并且病原菌和根瘤菌表現出顯著的交互作用 (P ＜ 0.05) (圖 1、表 1)。

2.2 接種病原菌對植物地上、地下生物量的影響

單獨接種根瘤菌處理(R+F-)比對照處理(R-F-)地上生物量高10.35%，而單獨接種病原菌(R+F-)和同時接種兩種菌(R+F+)比對照處理(R-F-)地上生物量分別低41.29%和30.88%。接種根瘤菌條件下，病原菌降低植株地上生物量37% (P ＜ 0.05) (圖2)。病原菌極顯著降低植物地上、地下生物量(P ＜0.01)，根瘤菌極顯著提高植物地上、地下生物量，但病原菌和根瘤菌交互作用對植物地上生物量無顯著影響 (P ＞ 0.05) (表 1)。

兩種微生物對植物地下生物的影響與地上生物量影響相似，病原菌(R-F+)和根瘤菌+病原(R+F+)處理下，植物根系干重較對照處理(R-F-)分別低20.69% (P ＜ 0.05)，12.48% (P ＞ 0.05)。根瘤菌處理(R+F-)比對照處理(R-F-)地下生物量高3.33% (P ＜0.05)。在接種根瘤菌條件下，病原菌處理降低植株地下生物量 15.39% (P ＜ 0.05) (圖 2)。

2.3 接種病原菌對植物地上、地下過氧化物酶的影響

根瘤菌+病原菌(R+F+)處理下，地上過氧化物酶活性最高，單接根瘤菌(R+F-)處理下植物地上過氧化物酶活性最低，根瘤菌+病原菌(R+F+)處理比單接根瘤菌(R+F-)植物地上過氧化物酶活性高37.63% (P ＜ 0.05) (圖 3)。與對照 (R-F-)相比，病原菌與根瘤菌單獨接種均未顯著影響植物地上過氧化物酶活性 (P ＞ 0.05)。

不同處理(R+F-、R+F+、R-F+)和對照(R-F-)之間地下過氧化物酶活性沒有顯著差異(P ＞ 0.05)(圖 3)。

2.4 接種病原菌對植物地上、地下木質素的影響

病原菌、根瘤菌以及兩者互作對植物地上木質素含量均無顯著影響(P ＞ 0.05) (表1)。各處理間植物地上部分木質素含量無顯著差異(P ＞ 0.05)，接種根瘤菌、或不接種根瘤菌同一處理下，感病植株均比健康植株地上木質素含量高(圖4)。

與單獨接種病原菌處理(R-F+)和對照相比，根瘤菌+病原菌處理(R+F+)分別提高植物根系木質素含量4.60%和32.58% (圖4)。病原菌侵染植物，顯著提高了植物地下木質素含量(P ＜ 0.05) (圖4)。

表1 根瘤菌及小扁豆刺盤孢互作的多因素方差分析P值Table 1 Rhizobium and Colletotrichum lentis interaction multivariate analysis of variance P value

圖2 不同處理下植物地上、地下部分生物量Figure 2 Shoot biomass and root biomass for different treatments

圖3 不同處理下植物地上、地下部分過氧化物酶活性Figure 3 Shoot and root peroxidase activity for different treatments

圖4 不同處理下植物地上、地下部分木質素含量Figure 4 Shoot and root lignin concentration for different treatments

2.5 接種病原菌對植物地上、地下茉莉酸的影響

病原菌、根瘤菌以及兩者互作對植物地上茉莉酸含量均未產生顯著影響(P ＞ 0.05) (表1)。不同處理(R+F-、R+F+、R-F+)與對照(R-F-)相比均沒有顯著差異 (P ＞ 0.05) (圖 5)。

單獨接種病原菌處理(R-F+)地下茉莉酸含量最高，比對照處理(R-F-)高70.34% (P ＜ 0.05)，單獨接種根瘤菌(R+F-)和同時接種兩種菌(R+F+)與對照處理(R-F-)相比無顯著性差異(P ＞ 0.05) (圖5)。在不接種根瘤菌條件下，病原菌侵染顯著提高了植物地下茉莉酸含量(P ＜ 0.05)。

圖5 不同處理下植物地上、地下部分茉莉酸含量Figure 5 Shoot and root jasmonic acid concentration for different treatments

2.6 接種病原菌對植物地上、地下多聚半乳糖醛酸酶的影響

病原菌顯著提高了植物地上多聚半乳糖醛酸酶活性(P ＜ 0.05) (表1)。單獨接種病原菌處理(R-F+)地上多聚半乳糖醛酸酶活性最高，比對照處理(RF-)高33.09% (P ＜ 0.05)，其他處理間植物地上多聚半乳糖醛酸酶含量相同(圖6)。

與對照(R-F-)相比，不同處理(R+F-、R+F+、R-F+)下植物根系多聚半乳糖醛酸酶含量相同(P ＞0.05) (圖6)。病原菌、根瘤菌以及兩者互作對植物地下多聚半乳糖醛酸酶活性均沒有顯著影響(P ＞0.05) (表 1)。

2.7 接種病原菌對植物地上、地下果膠甲基酯酶的影響

單獨接種病原菌處理(R-F+)的地上果膠甲基酯酶活性最高，比對照處理(R-F-)高10.74%( P ＞0.05)，其余各處理(R+F-、R+F+)均低于對照處理(R-F-)，只接種根瘤菌處理(R+F-)的地上果膠甲基酯酶活性最低，相比于對照組低26.5% (P ＞ 0.05)(圖7)。根瘤菌對植物地上、地下果膠甲基酯酶有顯著影響 (P ＜ 0.05) (表 1)。

單獨接種病原菌(R-F+)和單獨接種根瘤菌處理(R+F-)處理下植物地下果膠甲基酯酶含量最高和最低，單獨接種病原菌(R-F+)比單獨接種根瘤菌處理(R+F-)地下果膠甲基酯酶含量高19.83% ( P ＜0.05) (圖 7)。所有處理 (R+F-、R+F+、R-F+)與對照(R-F-)相比均沒有顯著差異(P ＞ 0.05)。

3 討論

本研究在溫室條件下，通過接種根瘤菌和病原菌，研究了箭筈豌豆新病原小扁豆刺盤孢炭疽病對我國青藏高原主要栽培的箭筈豌豆新品種-蘭箭3號春箭筈豌豆生長、生化及根瘤的影響，發現小扁豆刺盤孢可引致蘭箭3號春箭筈豌豆炭疽病，降低植物地上、地下干物質量，減少植物根系根瘤形成，引發植物抗病性相關生理生化系統響應，結果對于進一步研究該病害，制定病害防控措施具有積極的作用。

圖6 不同處理下植物地上、地下部分多聚半乳糖醛酸酶活性Figure 6 Shoot and root polygalacturonase activity for different treatments

圖7 不同處理下植物地上、地下部分果膠甲基酯酶活性Figure 7 Shoot and root pectinesterase activity for different treatments

豆科牧草生長主要依賴于地上部分光合以及根系養分吸收和固氮能力，病害的發生嚴重影響植物生長和根瘤形成。新病原小扁豆刺盤孢降低植物地上、地下生物量26.9%～40.0%，表明了病原菌具有很強的致病性及破壞性。研究表明，炭疽病病原菌產生的細胞壁降解酶促進植物葉片降解并影響植物地上部分的正常功能[34]。而李楊等[35]通過采取田間苜蓿褐斑病的葉片發現，植物的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率等隨病斑嚴重程度的增加而下降。此外，本研究表明相較于地下部分，葉片病害對地上部分生長的影響更為明顯，主要原因是病害影響植物葉片的光合作用和有機物的積累，從而直接影響地上部分的生長。

病害不僅影響植物的生長和光合，同時也會影響根系的發生和發展。Corriveau和Carroll[27]在田間試驗條件下，研究鐮刀菌(Fusarium)造成水勢脅迫對大豆(Glycine max)根瘤數量的影響發現，病害影響植物維管束系統，降低植物光合作用，減少光合產物向根部的運輸，限制結節形成并降低植物的根瘤數。侯天爵和周淑清[36]通過溫室試驗研究了霜霉病對紫花苜蓿生長和結瘤的影響發現，兩次試驗中苜蓿根瘤數平均減少了54.1%。本研究也發現，小扁豆刺盤孢炭疽病使植物有效根瘤數減少42.25%，與上述研究結果一致。因此，病害限制植物地上部分生長，并影響向根部養分的運輸，不僅導致地下生物量下降(圖2)，還會影響根瘤的形成，降低有效根瘤數(圖1)。根瘤的大小和數量下降也會造成植株固氮能力下降[37]，從而影響豆科牧草的利用。

與植物抗病相關研究較多的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、等可以提高植物抗氧化能力，增強植物抗逆性[38-39]。通常病原物的侵染誘導過氧化物酶活性升高，其在植物木質素的生物合成中起重要作用，可促進植物受侵染組織的木質化作用，從而形成物理屏障[40]。此外，病原菌的侵染也會導致植物體內茉莉酸含量升高[41]，由于茉莉酸可以誘導植物特異基因表達，合成相關防御蛋白，從而促使植物產生木質素等防御相關物質，提高植物抗病性[42]。本研究與上述研究結果一致，在接種根瘤菌的處理下，感病植物的過氧化物酶活性顯著高于健康植株(圖3)；在相同根瘤菌處理下，感病植物地下茉莉酸含量均高于健康植株(圖5)；在相同根瘤菌處理下感病植物地下、地上木質素含量均高于健康植株(圖4)。因此，植物會產生相關酶提高自身的抗氧化能力，并形成物理屏障響應病原菌的脅迫。果膠酶包括果膠甲基酯酶和多聚半乳糖醛酸酶等，有研究表明植物果膠酶在病原菌入侵過程中起重要作用[43-46]。李歡[47]以番茄(Lycopersicon esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)為研究對象，發現病原菌的侵染過程中可促使果膠甲基酯酶相關基因表達上調，從而抵御病原菌的侵染。但李艷青[48]以辣椒疫霉(Phytophthora capsici)為研究對象，發現病原菌在侵染植物的過程中會分泌降解植物細胞壁的多聚半乳糖醛酸酶，分解植物細胞壁的果膠，有利于病原菌侵染植物組織細胞而導致寄主病程發展。但Chen等[49]以龍眼為研究對象發現病原菌侵染植物導致寄主病程發展和多聚半乳糖醛酸酶活性升高，但寄主會通過多聚半乳糖醛酸酶抑制劑蛋白質基因表達上調進行防御[50]。本研究發現，單獨接種病原菌后，植物地上多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲基酯酶活性比對照處理分別高33.09%和10.74%(圖6、圖7)。所以，病原菌侵染過程中分泌并提高果膠甲基酯酶和多聚半乳糖醛酸酶活性，破壞植物組織細胞壁，有利于病原菌侵染和病程發展。

病原菌會導致水解酶活性升高，也有可能是宿主植物的自身防御機制，但最終均會破壞葉片的正常結構，從感病植物中植物地上部分兩種水解酶活性以及病情指數均是R-F+處理最高可以看出。這也許是炭疽病降低箭筈豌豆光合作用和有機物積累，并影響植物的正常功能，導致光合產物向根部的運輸減少，影響根系的生長和根瘤形成的主要原因。因此，病原菌侵染導致植物的正常生理功能和生長受到限制，表現為植物有效根瘤數，地上、地下生物量的減少。同時，病原菌的侵染會促進宿主植物自身防御，產生相關酶提高自身的抗氧化能力，并形成物理屏障抵御病原菌的侵染。綜上，可以認為病原菌的入侵可以提高植物體內抗病相關酶活性及物質含量，促進植物自身抗病相關水解酶、物質以及其他抗病相關系統之間的協調來響應病原菌的侵染。

4 結論

小扁豆刺盤孢對蘭箭3號具有很強的致病性，病原菌的侵染會分泌降解植物細胞壁的酶，破壞葉片的正常結構，直接降低植物的光合作用，限制地上部分生長以及向根部的養分運輸，從而導致地上、地下生物量的下降和減少根瘤的形成，影響植物在生產中的利用。同時，病原菌在侵染過程中，會促進箭筈豌豆自身抗病相關酶活性、物質等其他抗病相關系統之間的協調來響應病原菌的侵染。應加大對新病原引致炭疽病的研究，盡早制定有效防控措施，降低病害損失。