PEG引發紫花苜蓿種子的最優處理方案

趙曉晨，田 雨，張紅香

（1. 吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2. 中國科學院東北地理與農業生態研究所，吉林 長春 130102）

紫花苜蓿(Medicago sativa)作為優質高產的多年生豆科牧草，常作為草地補播、建植栽培草地和草田輪作的首選牧草。在國家政策的推動下，苜蓿產業在畜牧業發展、推進種植業結構調整、“糧改飼”和“種養結合”模式試點中發揮著越來越大的作用。由于苜蓿主要種植區大多處于干旱半干旱地區，且無灌溉設施，特別是春播時氣溫低，降水量少且不確定性強；加之苜蓿種子生產存在諸多限制因素[1]，導致市場上流通的種子存在純凈度差，發芽率低的現象，國產牧草種子市場流通的草種合格率不到60%[2]。因此，提高苜蓿種子及幼苗的抗旱性已成為干旱半干旱地區苜蓿栽培利用的一個重要環節。

種子引發(seed priming)是在一定的控制條件下使種子緩慢的吸收水分膨脹，為種子萌發提前進行生理準備的一種種子播前預處理技術。種子引發能夠產生“引發記憶”，不僅能夠打破種子的休眠，提高種子發芽速度和整齊度，還能提高種子幼苗的抗逆性[3-8]。常用的液體引發劑包括水、鹽(NaCl、KNO3、H2O2等)、PEG、植物激素 (GA、ABA等)。已有研究結果證實，種子引發能夠促進種子的發芽、幼苗出土以及作物產量。但已有研究主要集中在紫花苜蓿種子引發的最適條件等[9]，且多集中于引發作用的定性研究，而不同的苜蓿品種的引發條件尚需優化。

種子的活力是一個復雜的屬性，活力的高低決定了幼苗在不同生境中出土的均勻度，種子的萌發關系到種苗的建植能否成功，種苗生長可利用的水熱資源也受到種子萌發速率的影響。種子的活力受種子的壽命、遺傳因素、貯藏條件等因素的影響[4,10]。PEG (聚乙二醇)的主要功能是減緩種子在萌發初期吸收水分的速率，減少種子在吸收水分的過程中膜系統受到的損傷和對受損膜系統的修復[11]，激活體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等在內的多種保護酶的啟動，但在使用PEG的分子量、PEG濃度、浸種時間以及浸種溫度上也都存在著多種差異[12]。

因此，本研究通過正交設計優化PEG引發紫花苜蓿種子萌發的最優處理方案，以期為紫花苜蓿種子在退化草地和栽培草地建植中提供可行的種子預處理方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料選用公農一號紫花苜蓿(Medicago sativa‘Gongnong No.1’)，種子由吉林省農業科學院畜牧分院草地所提供，試驗前于4 ℃貯藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 引發方法

以PEG為引發劑，設置不同的PEG濃度(5%、10%、15%)、浸泡時間(12、24、36 h)及浸泡溫度(10、15、20 ℃)為試驗因素(表1)，將5 g種子置入廣口瓶中，按表2的組合分別加入PEG溶液，使種子完全浸沒在溶液里，立即搖晃以使種子與PEG溶液均勻接觸，以保證種子能夠引發充分，而后將廣口瓶置于恒溫培養箱中進行引發。在引發期間，每隔2 h將廣口瓶從培養箱中取出，輕輕搖晃，以確保種子能夠均勻地吸收水分[13]。引發結束后，將引發好的種子倒出，用蒸餾水將種子表面的引發劑充分沖洗干凈，平鋪置濾紙上，室內(室溫18.7 ℃，濕度38%)回干直至種子的初始含水量(5.66%)，回干后立即進行發芽試驗。

表1 PEG 6000引發試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of PEG 6000 priming test

表2 L9 (33)正交表頭設計Table 2 L9 (33) orthogonal header design

1.2.2 發芽試驗

按表2對種子進行處理，每個培養皿50粒，4次重復，以未引發處理為對照 。置于10～15 ℃(春季播種的土壤溫度)的人工氣候箱中進行培養，18 h/6 h(光照/黑暗)。每天計數發芽數，胚根突出種皮2 mm視為發芽，第7天測量幼苗根長與苗長，每皿隨機取10株進行測量，并計算平均值。在第14天時統計各培養皿中的正常和不正常苗、死種子、新鮮種子及種子的硬實數。

最終發芽率 = 發芽終期全部正常種苗數/(供試種子數 - 種子的硬實數) × 100%；

發芽速度(timson index) = 。

目前,通過水下機器人的協同作業來定期對船舶開展無損檢測和清污的維護工作,使其避免危險狀況的發生。然而,水下機器人協同作業通信中存在的傳輸數據率低,傳輸慢、安全性不高、干擾性大等問題,導致協同作業時的協調性和精確度降低。

式中：G為每天累計發芽率，t為試驗天數，在本試驗中發芽速度最大值為100，該數值越大，說明種子的發芽速度越快。

式中：N為最后一天的發芽數，ti為第i天，tj為第j天，ni為第i天的發芽數，nj為第j天的發芽數。

種子活力指數 = (根長 + 苗長) /T50，1/T50為萌發速率，即種子發芽率達到最終發芽率的50%所需要的時間的倒數。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量及SOD、POD、CAT酶活性的檢測

通過正交設計方案測定各發芽指標，首先篩選出幾個優良組合，然后進一步檢測其MDA(丙二醛)含量及SOD、POD、CAT酶活性，并最終篩選出PEG引發紫花苜蓿種子最優的處理方案。

1.2.4 數據分析

試驗數據采用SPSS Statistics 19.0軟件對所測定的數據進行分析比較，用平均值和標準誤表示試驗的測定結果，對同一處理濃度不同處理時間和溫度、同一處理時間不同處理濃度和溫度、同一處理溫度不同處理濃度和時間以及4種酶的活性進行單因素方差分析，并對各試驗數據采用Duncan法進行多重比較；圖表制作采用Excel 2010。

2 結果與分析

2.1 種子發芽指標及方差分析結果

處理組合Ⅰ(A1B1C1)的最終發芽率最低(圖1A)，平均只有95.12%，而處理組合Ⅶ(A3B1C3)的平均發芽率最高，平均可達98.17%。在達到最終發芽率50%所需的時間T50中，處理組合Ⅳ～Ⅷ顯著低于其他 5 種處理組合（P ＜ 0.05）(圖 1B)。引發后各處理的種苗長度均高于對照處理，并且除處理組合Ⅷ外其余處理均顯著高于對照（P ＜ 0.05）(圖 1C)。在種苗的活力指數中，處理組合Ⅳ～Ⅶ高于其他引發處理，處理Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ顯著高于對照組（P ＜ 0.05）(圖1D)。除此之外，引發還增加了組合Ⅳ～Ⅷ的發芽速度，處理組合Ⅳ顯著高于對照(圖1E)。綜上，引發加快了紫花苜蓿的發芽，促進了紫花苜蓿種苗的生長，增加了紫花苜蓿種苗的活力指數。

圖1 PEG引發后紫花苜蓿種子的發芽指標Figure 1 Germination index of alfalfa seeds after PEG priming

從方差分析表可知，A因素即PEG濃度對紫花苜蓿種子的發芽速度有顯著影響（P ＜ 0.05）(表3)，而處理時間和處理溫度對紫花苜蓿種子發芽速度則無顯著影響（P ＞ 0.05）。PEG濃度A的極差為27.806，處理時間B的極差為12.927，處理溫度C的極差為10.617 (表4)。綜上分析可判斷，3種試驗因素對紫花苜蓿發芽速度的影響程度大小依次為處理濃度、處理時間、處理溫度。

表3 方差分析表Table 3 RANOVA table

在各試驗因素水平中，PEG濃度為A2(10%)時對紫花苜蓿種子的引發效果最好，發芽速度達到91.603；處理時間B1(12 h)的效果最好，發芽速度達到84.527；處理溫度C3(20 ℃)的效果最好，發芽速度達到82.637 (表4)。但由于PEG濃度對紫花苜蓿的發芽速度影響顯著，而處理時間和處理溫度無顯著影響，因此，在選擇處理組合時 10%PEG濃度作為組合指標優選之一，與處理時間和處理溫度組合后通過生理指標測定來進一步篩選優選組合。

2.2 PEG處理對 MDA、SOD、POD、CAT酶活性的影響

為進一步比較優良組合，根據PEG濃度對紫花苜蓿種子萌發的影響結果，確定組合IV、V、VI進行MDA含量及SOD、POD和CAT酶活性的測定[14]。結果表明，處理Ⅴ(A2B2C3)紫花苜蓿種子MDA含量較少(表5)，SOD和POD酶的活性最高，且SOD與POD酶的活性顯著高于組合Ⅳ(A2B1C2)和組合Ⅵ(A2B3C1) ( P ＜ 0.05)，CAT酶的活性也具有較高的水平。處理Ⅳ各指標次之，處理Ⅵ相對較差。因此，處理組合Ⅴ為最優組合。

3 討論與結論

在衡量種子活力時，通常將種子的發芽指數與幼苗的生長勢結合在一起，種子的活力水平可以用活力指數來反映[15]。種子活力受種子壽命、遺傳因素、貯藏條件等因子影響，可通過引發技術得到提高[4,10]。種子引發作為一種種子播前預處理技術，常用于改善作物的田間表現[16]，能提高逆境下的種子活力，改善發芽和幼苗出土情況[17-18]。

一般來說，引發溫度15～25 ℃為大多數物種的最適溫度。而在本研究所得出的最優引發方案中，引發溫度為20 ℃便與此一致。研究表明，在種子最適的萌發溫度下對種子進行引發后，引發效果最佳[19]。引發效果受溫度的影響，隨溫度的降低而普遍下降，甚至還可能會影響之后種子的萌發，而溫度過高則會導致種子發生霉變[20]。如瓜爾豆(Cyamopsis tetragonoloba)低溫處理后發芽率僅為2%[21]。用PEG-1000引發大豆種子在較高溫度(17 ℃)的溶液中容易發霉[12]。

表4 紫花苜蓿正交試驗結果表Table 4 Results of orthogonal test

表5 PEG處理對紫花苜蓿種子MDA含量、SOD、POD及CAT酶的活性的影響Table 5 Effects of PEG treatment on the content of MDA, the activity of SOD, POD and CAT in alfalfa seeds

不同種子的最適引發時間也大都不同。例如在關于孜然(Cuminum cyminum)種子的研究中，用PEG引發48 h后顯著提高了孜然種子的發芽性能[22]；而在本研究中通過正交設計及4種酶活性的檢測所篩選出來的最優組合的引發時間為24 h。引發時間也同樣是決定引發成敗的關鍵。在引發沙打旺(Astragalus adsurgens)的研究中表明，引發時間過長超過72 h出現負效應，過短效果則不顯著[23]。用PEG引發白三葉(Trifolium repens)時，引發時間為最長72 h時，顯著縮短了T50[24]。

細胞抵御活性氧傷害保護酶系統的主要組成成分是SOD、POD和CAT，對清除自由基和阻止自由基的形成方面具有重要的作用[15]。在評價種子活力時，通常可以用種子內部對超氧自由基的清除能力來評價。在這一過程中，清除系統與許多酶如SOD、POD和CAT等保護酶密切相關。大量研究表明，引發能夠提高種子的發芽率，加快種子的發芽速度，改善種子的抗逆性，增強SOD和CAT酶的表達和活性，從而增加作物的產量。種子在貯藏過程中導致種子活力下降和阻礙種子萌發的主要原因之一是膜脂過氧化所產生過量的活性氧。膜質過氧化作用的主要產物是MDA，其含量的高低可以反映出膜質過氧化作用的程度[25]。在覃柳燕等[26]關于山豆根(Sophora tonkinensis)種子的研究中發現，在一定的范圍內SOD、POD和CAT酶的活性越高，對種子組織的保護能力就越強。本研究結果表明，引發加快了種子的發芽速度，激活了紫花苜蓿體內 SOD、POD和CAT等保護酶的啟動，增強了清除活性氧和自由基的能力，減輕了紫花苜蓿膜脂過氧化作用，有效地保護了紫花苜蓿的細胞膜系統，減少了影響種子萌發過程中帶來的不利因素，提高了種子的活力。玉米(Zea mays)種子經過引發后能夠快速萌發，具有更高的出苗指數、萌發速度、活力指數和幼苗活力，并且改善了根長、苗長以及幼苗的鮮重和干重[27]。同時，引發作用能夠增加光合色素、葉綠素a/b，激活SOD和APX酶活性、增加脯氨酸、甜菜堿含量[28]。小麥種子經-0.9 MPa PEG引發后，植株遇到干旱脅迫時生理指標均顯示出優于未引發的植株，如相對生長率、產量、葉綠素a/b、凈光合速度、氣孔導度等降低的程度較小，CAT、APX和GR酶活性較高等[29]。

本研究的最佳引發組合，即在溫度為20 ℃的條件下，濃度為10%的PEG-6000溶液中浸泡24 h后能顯著提高紫花苜蓿的萌發速率，提高種子活力。

PEG引發就是通過不同濃度的PEG調節溶液的滲透壓來達到引發種子的目的，所以引發成敗的關鍵在于選擇適宜濃度的PEG。最適濃度的PEG是能最大限度地水合而不讓其發生可見的萌發[12]。研究表明，不同PEG的濃度對引發的效果也存在著影響。對孜然種子的研究發現，用7% PEG引發的種子的最終發芽率顯著高于用9% PEG引發的種子和未引發的種子。在15 ℃下用7% PEG引發2 d的孜然種子增強了種子的耐旱性；在9% PEG引發的孜然種子則表現出對發芽率和發芽勢的提高[22]。用PEG引發3種老化大豆發芽時，20%和30%的PEG的引發效果要高于10%的PEG[30]。