羧肽酶A抑制劑Latexin基因的原核表達與純化

劉成倩，李 紅，高 駿，姚惠娟，易建中，孫鳳萍

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

Latexin蛋白是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種羧肽酶A（Carboxy peptidase A，CPA）抑制劑［1］，能在體內(nèi)外非競爭性地、不可逆地抑制CPA的蛋白水解作用［2］，并且在肥大細胞中表現(xiàn)抑制羧肽酶A活性而加強羧肽酶B活性的特性。

因Latexin基因主要表達于單核巨噬細胞中，所以單核巨噬細胞豐富的肝臟和脾臟中其表達量很高。另外，Latexin基因在心臟、前列腺、卵巢、胰腺、腎中也有高表達［3］。研究表明，Latexin蛋白可調(diào)控干細胞的生長及調(diào)節(jié)造血干細胞中多種蛋白的豐度，并且能夠酶解白三烯（LTC4）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等多種炎癥因子，Latexin蛋白與炎癥的發(fā)展密切相關(guān)［4-5］；也有研究表明，Latexin基因的表達可能參與腫瘤的抑制［6-7］。因此，克隆和表達該基因具有重大的應(yīng)用價值。

本試驗從一種分化好的人肝胚細胞瘤細胞株HepG2中克隆Latexin基因，并進行高效表達研究，以期為深入探討Latexin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因、菌種及試劑

pET30a質(zhì)粒、HePG2細胞、大腸埃希氏菌種DH5α、Transetta（DE3）均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所病毒課題組提供。rTaq酶及內(nèi)切酶EcoRⅠ、SacⅠ和T4 DNA連接酶均購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海嘉儀生物有限公司。Western-Blot顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成及HePG2細胞總RNA的抽提

根據(jù)GenBank已發(fā)表的Latexin基因序列，利用Premier5.0軟件，設(shè)計1對特異性引物（Latexin-F/R），序列為Latexin-F：ATACCGGAATTCATGGAAATCCCGCCGACC，Latexin-R：TTAGGGTTTTTGTTTATTCCAGT，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。預(yù)期擴增Latexin基因產(chǎn)物長度為681 bp。

按照Trizol試劑說明書進行HePG2細胞總RNA的提取。

1.3 目的基因的擴增

反轉(zhuǎn)錄體系 20μL：RNA模板 5μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1μL，Latexin-R 1μL（10μmol/L），DEPC水3μL，在冰上混合，65℃ 水浴5 min，冰浴2 min；之后再加入4μL 5×反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer，1μL RNase，1μL反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/μL），4μL DEPC水。在冰上混合，42℃ 1 h，再70℃ 5 min。

PCR反應(yīng)體系50μL：模板 3μL，10×Buffer（Mg2+free）5μL，MgSO44μL，dNTP（2 mmol/L）5μL，Latexin-F/R（10μmol/L）各1.5μL，KOD-Plus酶 2μL，ddH2O 29μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃45 s，55℃ 45 s，68℃ 90 s，35個循環(huán)；最后 68℃ 延伸 10 min。

1.4 Latexin基因連入T載體

Latexin基因PCR產(chǎn)物回收片段與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定陽性的克隆送往上海華大基因科技股份有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為PMD18-T-Latexin。

1.5 Latexin基因表達載體的構(gòu)建與鑒定

利用內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅠ分別對PMD18-T-Latexin質(zhì)粒和PET-30a質(zhì)粒進行雙酶切，Latexin基因雙酶切產(chǎn)物和PET-30a載體連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。將菌落PCR和酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送往上海華大基因科技股份有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為PET-30a-Latexin。

1.6 PET-30a-Latexin重組菌誘導(dǎo)表達

將測序正確的質(zhì)粒PET-30a-Latexin轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Transetta（DE3），涂Kan+板，37℃培養(yǎng)過夜。在超凈臺內(nèi)挑取單菌落接種到含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min振搖16 h，1∶100稀釋到含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min振搖約2 h，測其OD值。當OD600達0.4左右時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)5 h，收集菌體。

1.7 重組菌大量誘導(dǎo)及可溶性分析

菌液培養(yǎng)的方法同1.6節(jié)，再取1 mL PET-30a-Latexin菌液接到100 mL LB中，37℃振搖培養(yǎng)約2 h至OD600達0.4左右時，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，再37℃振搖培養(yǎng)5—7 h，取出菌液5 000 r/min離心8 min，棄上清，沉淀加入15 mL PBS懸浮，同樣的轉(zhuǎn)速離心，棄上清，之后菌體加入超聲波液懸浮，經(jīng)超聲破碎，8 000 r/min離心10 min，上清液保留備用，沉淀用10mL PBS懸浮，超聲后上清液和懸浮后的沉淀分別加入5倍上樣緩沖液，煮沸5 min，之后進行SDS-PAGE檢測。

1.8 W estern-Blot分析

將1.7節(jié)的電泳蛋白膠按半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)PVDF膜，條件是電流60 mA，轉(zhuǎn)印時間約50 min。加入5%的脫脂奶粉封閉30 min，以抗His標簽鼠單克隆抗體為一抗孵育1.5 h，用PBST洗滌3次，每次5 min［8］；再用山羊抗小鼠IgG HRP標記的二抗孵育1.5 h，用PBST洗滌3次，每次5 min，最后用PBS洗滌1次；加入底物在暗房內(nèi)曝光顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的PCR擴增

以抽提的HePG2細胞總RNA為模板，以Latexin-F/R為引物進行RT-PCR擴增，得到的擴增條帶為681 bp，與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 pMD18-T-Latexin菌落PCR篩選

Latexin基因的PCR產(chǎn)物回收片段與T載體連接轉(zhuǎn)化后，挑取6個大而圓的菌落按照菌落PCR篩選方法進行擴增，結(jié)果見圖2。取陽性菌測序，測序結(jié)果經(jīng)比對后顯示為正確。

圖1 Latexin基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Latexin gene

圖2 pMD18-T-Latexin菌落PCR篩選結(jié)果Fig.2 PCR screening results of pMD18-T-Latexin colony

2.3 重組原核表達載體的構(gòu)建及雙酶切鑒定

質(zhì)粒pMD18-T-Latexin與pET-30a酶切連接轉(zhuǎn)化后，通過初步篩選，將陽性克隆命名為pET-30a-Latexin，重組質(zhì)粒pET-30a-Latexin經(jīng)EcoRⅠ、SacⅠ雙酶切后出現(xiàn)5 422 bp和681 bp的條帶，與理論值相符（圖3），表明重組質(zhì)粒pET-30a-Latexin構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)與可溶性分析

重組菌pET-30a-Latexin誘導(dǎo)后，經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分析，明顯可見一條約32 ku大小的新生條帶（圖4），且目的蛋白在超聲后的上清液中，說明重組蛋白為可溶性蛋白。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.3 Double digestion results of recombinant plasm id

圖4 pET-30a-Latexin重組菌的誘導(dǎo)表達Fig.4 Induced expression of pET-30a-Latexin recombinant bacterium

2.5 重組蛋白的W estern-Blot分析

純化后的蛋白先進行10%的SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)PVDF膜，暗房內(nèi)曝光顯影后在32 ku處有一目的條帶（圖5），表明重組蛋白能與His標簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖5 重組蛋白的W estern-Blot分析結(jié)果Fig.5 W estern-Blot analysis of recombinant protein

3 討論

CPA為外肽酶，具有從羧基端降解肽鏈的肽酶活性，Latexin蛋白可在體外抑制CPA的蛋白水解作用。關(guān)于Latexin蛋白功能的研究報告目前還不是很多，主要為對干細胞的調(diào)節(jié)作用及對炎癥及腫瘤抑制的應(yīng)用方面。李圣青等［5］研究表明，大鼠急性肺栓塞后肺泡巨噬細胞（AMs）中Latexin蛋白的表達顯著升高，CPA3的酶解作用被抑制，促進了肺部炎癥的發(fā)展和肺血管的收縮。Takaishi等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在白血病和淋巴瘤患者血中Latexin蛋白的表達水平比正常人有明顯降低，說明Latexin蛋白很可能參與了癌變過程。Yong等［7］研究表明，Latexin蛋白可以抑制人胃癌細胞生長，提示Latexin蛋白的表達可能參與腫瘤的抑制。Muthusamy等［9］研究表明，Latexin蛋白在黑色素瘤細胞系的外源表達對腫瘤細胞的增殖有顯著抑制作用。這些研究結(jié)果都揭示了Latexin蛋白的抗癌潛力。家禽的腫瘤性疾病是一類流行于世界范圍內(nèi)的禽類傳染病，其研究不僅在家禽生產(chǎn)上具有重要意義，而且還可以作為人類癌癥研究的動物實驗?zāi)Ｐ汀＝鼛啄陙恚仪菽[瘤病的研究也日益受到重視。因此，克隆和表達該基因?qū)ρ芯考仪菽[瘤病具有一定的意義。

本試驗通過克隆得到Latexin基因，經(jīng)過表達條件的優(yōu)化實現(xiàn)了重組基因的高效表達，且表達的蛋白為可溶性的，經(jīng)純化得到較純的目的蛋白，獲得的Latexin蛋白后續(xù)制備的抗體可為禽類腫瘤性疾病的臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。