分揀微管連接蛋白17在重癥肌無力中的表達及相關性分析

馬健鈺

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是最常見的神經肌肉接頭免疫疾病，以突觸后膜乙酰膽堿受體數量減少、結構變化導致的終板膜崩解為主要病理特征。研究［1］發現重癥肌無力可受多基因調控并具有較高的遺傳傾向，與免疫球蛋白重鏈基因、T細胞受體基因及乙酰膽堿受體均具有密切聯系。

研究［2］證實低密度脂蛋白受體相關蛋白與膜表面MuSK形成的復合體對于神經肌肉接頭的功能至關重要。此外，先前的研究［3］發現重癥肌無力病人的肌肉組織分揀微管連接蛋白17（sorting nexin 17，SNX17）表達水平較高，與乙酰膽堿受體亞單位基因共定位于神經肌肉接頭，低密度脂蛋白受體相關蛋白 4（low density lipoprotein receptor-relatedprotein，LRP4）在細胞內的代謝與SNX17關系密切，但國內研究資料較少。故此，本研究就SNX17蛋白在重癥肌無力中的表達情況，并分析其與重癥肌無力發病的關系，探討其臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年10月至2016年12月南陽市第一人民醫院確診的重癥肌無力病人（MG組）80例（MG組）、健康對象50例（對照組）。MG組，男性43例，女性37例，年齡范圍為25～56歲，年齡（37.6±11.2）歲，；病臨床分期Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期17例；Ⅳ期21例；胸腺瘤22例，胸腺增生18例，眼肌型16例，全身型24例；對照組，男性30例，女性20例，年齡范圍為23～52歲，年齡（35.5±10.3）歲，無MG及其他自身免疫性疾病。兩組病人的年齡、性別比較，差異無統計學意義（t＝1.072，χ2＝0.488，P＝0.286、0.347）。病人或近親屬對研究方案均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入排除標準［4］

1.2.1納入標準 ①術前未合并其他部位疾病；②術后病理證實為重癥肌無力；③手術根治性切除胸腺組織；④有完整規范的術后病理報告及隨訪資料；⑤無高血壓、糖尿病、腎炎、急慢性盆腔炎及子宮內膜異位癥等疾病，近期均未服影響前列腺素和血栓素代謝的藥物。

1.2.2排除標準 ①合并其他系統嚴重疾病者。②未能完成隨訪者。③貧血及凝血功能障礙；④風濕及免疫系統疾病；⑤嚴重的肝腎功能疾病；⑥甲狀腺功能障礙；⑦因其他部位腫瘤進行過放化療治療者。

1.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫組化染色方法、蛋白質印跡法SNX17引物依據Genebank公司合成的SNX17和β-actin基因序列設計TRIzol法提取胸腺總RNA，逆轉錄合成cDNA；具體反應體系參照朱明振等［5］的研究，MG組與對照組SNX17、cDNA及內參β-action引物一起擴增。

免疫組化染色法觀察胸腺組織SNX17分子形態，待檢組織甲醛固定后在波片上將單根肌絲剝離，5%BSA 1h封閉后，1∶50鼠抗人SNX17抗體4℃孵育過夜；30 min的37℃復溫，1∶100AF-g350標記羊抗鼠抗體和α-BTX，1 h孵育（37℃），顯微鏡下觀察不同激發光下的SNX17形態和分布情況［6］。

蛋白印跡法檢測胸腺細胞中SNX17的蛋白含量，待檢標本研磨成勻漿后加入裂解液，30 min室溫避光保存30 min，離心（5 000 r/min）5 min后取上清，BCA法側蛋白濃度，β-actin為內參，每孔20 uL樣品，1∶1 000鼠抗人SNX17抗體和1∶2 000兔抗人β-actin抗體4℃孵育過夜，30 min的37℃復溫，1∶4 000 HRP標記羊抗鼠抗體和1∶4 000 HRP標記的羊抗兔抗體1 h孵育（37℃），曝光膠片，Quantity One軟件測定［7］。

1.4 結果判定標準

1.4.1免疫組化判定標準 陰性對照用PBS代替一抗進行染色，結果做為陰性；標準光鏡下以細胞漿、膜中出現細胞核著色或粗細一致的棕黃色顆粒為陽性染色；采取二次計分法：先將染色按強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細胞百分比計分，0分為陽性細胞為＜25%，1分為25%．50%，2分為51%．75%，3分為≥75%。用染色強度得分與細胞數得分之和作為判斷表達的結果，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。所有病理切片均由高年資病理醫師盲法評定結果［8］。

1.4.2RT-PCR、蛋白質印跡判定標準 分別以每例標本SNXl7與β-actin Ct值之比，作為該例標本目的基因mRNA的相對表達量；蛋白質印跡曝光結果以膠片上出現目SNX17和β-actin內參條帶，且β-actin內參基因的曝光條帶在MG組和對照組灰度一樣［9］。

1.5 統計學方法統計軟件采用SPSS 17.0，計量資料采用±s進行統計描述，兩組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組組織標本中SNX17蛋白的表達情況比較SNX17蛋白在重癥肌無力胸腺組織中的表達明顯高于對照組（χ2＝28.208，P＝0.000），見表1。

表1 重癥肌無力病人和健康對照者組織標本中SNX17蛋白表達情況比較

2.2 兩組組織標本中SNX17 mRNA及蛋白的表達水平比較MG組SNX17 mRNA含量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），見表2。SNX17蛋白含量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），見表3。

表2 重癥肌無力病人和健康對照者標本中SNX17 mRNA含量比較

表3 重癥肌無力病人和健康對照者標本中SNX17蛋白含量比較

2.3 重癥肌無力胸腺組織標本中的SNX17蛋白表達與病人臨床病理學特征的關系SNX17蛋白表達和相對含量在不同的性別、年齡、臨床分期、組織學分級間比較，均差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 重癥肌無力胸腺組織SNX17蛋白表達與臨床病理因素的關系/例（%）

3 討論

MG屬于一類自身免疫性疾病，年發病率為4～11/100萬，患病率為77～150/100萬，女性患病率大于男性，約3∶2，各年齡段均有發病，本病臨床表現多樣，存在全身骨骼肌無力和易疲勞等表現［10］。MG主要有兩種病理變化：（1）神經-肌肉接頭突觸后膜終板膜乙酰膽堿受體亞單位基因數量減少；（2）是胸腺異常，主要涉及AChR抗體、MuSK抗體和LRP4抗體加速相應自身抗原溶解或直接抑制其功能，阻礙AChR在突觸后膜聚集，影響神經沖動的傳遞，進而導致肌無力［11］。

最新的研究［12］在胞膜內吞轉運方面發現了重要的新型調節蛋白家族—SNX家族，該家族主要位于細胞溶酶體內，它們的過度表達能夠調節細胞膜表面受體轉運并位于早期內涵體小室的特殊部位，被鑒定為和LDLR家族成員相互作用的合體。因此，MG病人淋巴細胞分化程度與胸腺SNX17表達密切相關，高表達的SNX17可促使胸腺細胞內吞率上升，并以此影響病人免疫功能，最終參與MG。但目前國內研究資料較少，本研究深入探討了SNX17蛋白在重癥肌無力中的表達情況，結果顯示SNX17 mRNA及蛋白在重癥肌無力病人中表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），說明SNX17蛋白與重癥肌無力發病具有密切的關聯，這也與先前的研究相符［13］。

SNX17蛋白屬于部分細胞表面短暫表達的細胞粘附蛋白，與血小板選擇蛋白胞漿結構具有相互作用，并調節粒細胞與血小板選擇蛋白的相互作用［13］。LDLR具有重要的膽固醇代謝及脂肪代謝的調節作用，作為重要的細胞膜蛋白，可介導血漿低密度脂蛋白在細胞間的出入。因而，SNXl7的高度表達可能導致病人脂肪代謝紊亂，參與MG的發病、發展過程。此外，研究［14］提示SNXl7的高度表達能影響淋巴細胞的分化，增強胸腺細胞內吞率，進而影響機體免疫功能并參與MG發生過程。研究［15-16］報道SNX17能降低溶酶體降解速率并抑制血小板選擇蛋白進入溶酶體，并誘導免疫細胞的細胞非正常增殖，導致機體合并免疫耐受終止癥狀。因此，臨床研究認為SNX17可通過介導溶酶體的活性，誘使T淋巴細胞的異常增殖而誘發MG。本研究發現SNX17蛋白的表達與病人組織學分化程度、臨床病理學分期及淋巴結轉移情況無明顯關系。上述結果提示SNX17蛋白與MG的發展過程并無顯著聯系，但具體機制還需要相關研究深入探討、證實。

綜上所述，SNX17蛋白與重癥肌無力發病具有密切的關聯，與臨床病理參數無明顯的關系。