黃喉擬水龜對冬眠期間急性高溫脅迫的氧化應激響應

陳 威,胡小瑜,蔣柳陽,瞿瀟月,朱菁華,徐志旺,李樹然,張永普

溫州大學生命與環境科學學院, 溫州 325035

由于生理體溫調節機制較弱,外溫動物體溫受環境溫度影響較大,其生理和行為更易受環境溫度制約[1- 3]。對于外溫動物而言,冬眠期間是其較為脆弱的時期,此時很難通過行為體溫調節迅速響應溫度的變化,外界氣溫的變化將直接影響其生理生化狀態[4]。作為外溫動物的代表類群,爬行動物是受未來氣候變暖威脅最為嚴峻的類群之一[5- 6]。隨著氣候變暖的加劇,冬季溫度升高,甚至極端高溫出現的情形增多[7],爬行動物冬眠期間受到急性溫度脅迫的可能性大大增加,探討冬季溫度波動對爬行動物的影響,不僅是今后研究氣候變暖對生物影響的新熱點領域,也能夠為爬行動物保護提供前瞻性和預防性對策[8]。

已有研究表明,劇烈的溫度變化,如急性冷暴露或者高溫脅迫,會刺激外溫動物機體內活性氧增多,導致脂質過氧化物,如丙二醛(MDA)的含量增加,并加劇細胞膜的損傷[9- 11];而外溫動物機體的抗氧化防御系統,如抗氧化酶系統,包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等,則可以清除機體多余活性氧,以抵御其對機體的損傷[12- 13]。然而,目前有關冬眠期間的高溫脅迫對外溫動物的氧化應激以及抗氧化系統影響的研究僅見于一些兩棲類和魚類,對爬行類的研究則極為匱乏[14- 15]。

黃喉擬水龜(Mauremysmutica)是典型的具有冬眠特征的爬行動物,在我國主要分布于浙江、江蘇、安徽、廣西、廣東、海南、福建、臺灣等地。由于黃喉擬水龜的這種跨緯度遠距離分布,其冬眠期間的環境溫度也存在明顯的緯度變異。因此,黃喉擬水龜是研究爬行動物冬眠期間受環境溫度調控氧化應激和抗氧化防御動態平衡的理想系統。本實驗以浙江(代表高緯度的北方種群)和廣西(代表低緯度的南方種群)兩個種群的黃喉擬水龜幼體為研究對象,通過比較南北兩個種群在冬眠期間急性高溫刺激下的氧化應激反應以及抗氧化酶系統的響應,揭示不同種群的黃喉擬水龜幼體對極端溫度變化的生理適應策略與生化基礎,不僅為該物種的保護和養殖提供一定的參考,同時對預測其受氣候變暖的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為2017年孵出的一齡黃喉擬水龜幼龜,分別購于浙江海寧(30°19′N,120°25′E)和廣西桂平(23°60′N,110°12′E)的養殖場,南北種群各40只。所購黃喉擬水龜幼體均為當地物種來源,具有純凈的遺傳背景和本地適應特征[16]。

1.2 實驗過程

冬眠前,將黃喉擬水龜南北種群幼龜置于塑料養殖槽(長 × 寬 × 高=45 cm × 27 cm × 25 cm)中,每個槽內隨機分配南種和北種幼龜各5只,槽內盛5 cm深的水,每天上午10時投喂足量的龜糧,飼養溫度與室溫相同,光周期為自然光周期,每日下午用脫氯自來水換水。

當飼養室環境溫度降至12℃時,將幼龜連同塑料養殖槽轉移至BINDER培養箱中(KB400,BINDER GmbH,Tuttlingen),溫度設置從12℃開始,每24 h降低1℃,7 d后降至6℃,人工誘導其進入冬眠并在6℃中冬眠1個月。隨后,每個種群隨機選取8只幼龜取樣(對照0 h組);然后將各種群剩余幼龜置于25℃培養箱中,在經歷高溫處理2 h(高溫2 h組)和12 h(高溫12 h組)時各取樣一次,剩余個體放回6℃培養箱中,恢復24 h后再次取樣(恢復24 h組)。南北種群各組取樣樣本均為8只。

取樣時采用斷頭法迅速處死幼龜,在冰盤上迅速分離心臟、腦、肌肉和肝臟組織,液氮冷凍,然后置于超低溫冰箱(CryoCube F570,Eppendorf,Hamburg)-80℃下保存備用。

1.3 MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活力的測定

測定前,將組織塊按重量(g): 體積(mL)=1∶9的比例加入0.85%的冷生理鹽水于勻漿管中,冰水浴環境下盡快剪碎組織塊,用組織勻漿機進行快速研磨,制成10%的組織勻漿液。將制備好的勻漿液用低溫離心機(5810R,Eppendorf,Hamburg)以3000 r/min離心15 min,取上清液進行測定。

采用南京建成生物工程研究所生產的丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒測定各組織中MDA含量、SOD 活力,以及肝臟CAT 活力和GSH-Px活力(腦、心臟和肌肉的組織量在測定MDA含量和SOD 活力之后已不足以測定CAT和GSH-Px),具體操作按照說明書的要求進行。由于幼龜心臟重量較輕,各種群每個處理隨機取兩個個體的心臟合并測定MDA含量和SOD活力。

1.4 數據處理

用Statisitca 6.0統計軟件包分析數據。用Kolmogorov-Smirnov檢驗與Bartlett′s檢驗分別檢驗數據的正態性與方差均質性。MDA含量、SOD活力、CAT活力和GSH-Px活力采用雙因子方差分析(Two-way ANOVA),多重比較均采用LSD檢驗。描述性統計值用平均值±標準誤表示,顯著性水平設置為α=0.05。

2 結果

2.1 MDA含量

冬眠期間急性高溫脅迫對黃喉擬水龜兩個種群幼龜心臟MDA含量均無顯著影響;南種大腦MDA含量在高溫處理2 h較初始對照顯著降低(P<0.05),北種則不受溫度處理影響(P> 0.05);南種群肌肉MDA含量未受溫度處理影響(P> 0.05),而北種群肌肉MDA含量則在高溫處理12 h達到最高(P<0.05),恢復24 h后降至初始對照水平;南種群肝臟MDA含量隨處理時間增加逐漸升高,在恢復24 h達到最高(P<0.05),北種群肝臟MDA含量則不受溫度處理影響(P> 0.05)。總體上,南北種群心臟、大腦、肌肉等組織MDA含量無顯著種群差異(P> 0.05),南種群幼龜肝臟MDA含量顯著高于北種(P<0.05)(圖1)。

圖1 冬眠期間高溫處理對黃喉擬水龜幼龜南北種群各組織MDA含量的影響Fig.1 Effect of heat stress during hibernation on MDA content in different tissues of the southern and northern populations of Mauremys mutica不同大寫字母代表黃喉擬水龜南種群各處理間差異顯著,不同小寫字母代表北種群各處理間差異顯著,星號代表同一處理南北種群間存在差異

2.2 SOD活力

冬眠期間高溫刺激僅對北種群大腦SOD活力產生顯著影響,北種群大腦SOD活力在高溫處理2 h和12 h顯著高于高溫處理后恢復24 h(P< 0.05);其余組織中SOD活力均不受溫度處理的影響(所有的P> 0.05)。南北種群各組織中SOD活力均不存在顯著的種群間差異(所有的P> 0.05)(圖2)。

2.3 CAT活力

南種群的肝臟CAT活力在高溫處理2 h顯著高于高溫處理12 h以及恢復24 h組(P< 0.05),北種群不受溫度處理影響(P> 0.05);同時,南種群各處理組CAT活力均高于北種群(P< 0.05)(圖3)。

2.4 GSH-Px活力

南種群肝臟GSH-Px活力不受溫度處理影響(P> 0.05),而北種群肝臟GSH-Px活力在高溫處理12 h達到最高(P< 0.05),且高于南種群各處理組(P< 0.05)(圖3)。

3 討論

3.1 急性高溫脅迫對冬眠黃喉擬水龜脂質過氧化作用的影響

冬眠期間的高溫脅迫能夠促使外溫動物代謝水平迅速增加,產生過量的活性氧,造成氧化應激損傷[17]。本研究發現,黃喉擬水龜幼體冬眠期間經歷急性高溫刺激后,肌肉和肝臟MDA含量升高。類似的,高溫脅迫亦會引起其他外溫動物,如中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),組織MDA水平的升高[18]。此外,不同種群的黃喉擬水龜對冬眠期間急性高溫刺激的反應存在明顯差異：北種群在經歷12 h的高溫刺激后,肌肉MDA含量達到最高,但在放回6℃冬眠條件24 h后又恢復至對照水平,肝臟MDA含量則不受高溫刺激的影響;南種群幼龜肌肉MDA含量未受高溫刺激的影響,但肝臟MDA含量則隨高溫刺激時間的增長而逐漸升高,甚至在放回6℃冬眠條件恢復24 h后仍在升高,并且南種群肝臟MDA含量高于北種。這表明雖然冬眠期間的急性高溫可能會對黃喉擬水龜南北種群均產生一定的脂質損傷,但黃喉擬水龜北種群機體能夠更快地降低細胞膜上的脂質過氧化反應,以減少細胞膜損傷,而南種群則可能受冬眠期間高溫脅迫的脂質損傷更大。這可能是由于低緯度生存的外溫動物由于棲息地環境溫度波動較小,導致其代謝率等生理功能的溫度敏感性更高,而高溫度棲息的外溫動物由于棲息地環境溫度波動較大而生理功能對溫度的敏感性較低導致[19]。

3.2 急性高溫脅迫對冬眠黃喉擬水龜抗氧化酶活性的影響

急性溫度脅迫下,外溫動物機體活性氧增加,而抗氧化防御系統成分的活性或含量改變,如SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力升高,清除活性氧以緩解氧化應激對機體的損傷[20-21]。在本研究中,面對冬眠期間的高溫脅迫,黃喉擬水龜兩種群幼龜SOD活力在心臟、大腦、肝臟、肌肉等器官中均表現出一定地上升趨勢,但并未達到顯著水平。這暗示了SOD活力對于黃喉擬水龜應對冬眠期間的急性高溫脅迫作用有限。類似的,高溫脅迫冬眠的金魚(Carassiusauratus)各組織SOD活力均無顯著影響[15]。相反的,冬眠的湖蛙(Ranaridibunda)在受到急性高溫刺激后,肝臟和肌肉SOD活力升高超過2倍[14]。

肝臟的抗氧化防御系統高度發達,對于冬眠期間的外溫動物,肝臟抗氧化酶在清除氧化應激產物方面有重要作用[14,22]。冬眠期間的黃喉擬水龜幼龜在受急性高溫刺激后,雖然肝臟SOD活力升高不明顯,但CAT活力和GSH-Px活力顯著上升,這表明CAT與GSH-Px可能是冬眠期間黃喉擬水龜幼龜應對溫度劇烈波動造成的氧化應激的關鍵酶。同時本研究發現,這兩種酶活力對高溫刺激的響應在黃喉擬水龜南北種群中表現各異：南種群肝臟中CAT的活力在高溫刺激2 h后迅速上升,隨后逐漸降低,同時各組間南種群CAT活力均高于北種群,而肝臟GSH-Px活力對高溫刺激不敏感;相反的,北種群肝臟CAT活力并未受冬眠期間高溫刺激的影響,而北種群幼龜肝臟GSH-Px活力隨高溫刺激時間延長而上升,在高溫刺激12 h 達到最高。這表明冬眠期間黃喉擬水龜南種群可能始終面臨較北種群更高的氧化應激水平,而機體通過維持較高的CAT活性以應對這種威脅,這可能是南種群為應對其易受環境變化的影響以及由此帶來的氧化應激對機體的損害,而形成的自我保護措施[23];而黃喉擬水龜北種群在面對急性高溫脅迫時,肝臟中GSH-Px可能起著主導作用。

圖2 冬眠期間高溫處理對黃喉擬水龜幼龜南北種群各組織SOD活力的影響Fig.2 Effect of heat stress during hibernation on the SOD activity in different tissues of the southern and northern populations of Mauremys mutica不同小寫字母代表北種群各處理間差異顯著

圖3 冬眠期間高溫處理對黃喉擬水龜幼龜南北種群肝臟CAT活力和GSH-Px活力的影響Fig.3 Effect of heat stress during hibernation on the CAT and GSH-Px activity in livers of the southern and northern populations of Mauremys mutica不同大寫字母代表黃喉擬水龜南種群各處理間差異顯著,不同小寫字母代表北種群各處理間差異顯著,星號代表同一處理南北種群間存在差異

綜上,冬眠期間急性高溫脅迫對黃喉擬水龜幼龜產生了一定程度的氧化損傷,而黃喉擬水龜可在短時間內通過增強抗氧化酶(CAT與GSH-Px)活力來清除體內由于氧化應激產生的活性氧,以減輕機體的氧化損傷。同時,面對冬眠期間急性高溫脅迫,南北種群的氧化應激損傷以及抗氧化能力均表現出了一定的地理變異,南方種群可能更易受到冬眠期間溫度波動的影響,但機體具有更強的抗氧化酶(CAT)活力以應對高溫脅迫的威脅。因此,我們的研究表明外溫動物響應冬眠期間溫度變化的生理策略存在顯著的種群間差異,并且提示了我們在研究氧化應激和抗氧化平衡時,應注重種群來源以及其棲息地溫度環境特征的重要性。同時,對于黃喉擬水龜的保護,應當針對不同種群氧化應激反應的差異采取不同的措施。