島嶼生境下黃毛鼠種群的遺傳變異

劉小麗,孫 佼,韓金巧,王艷妮,2,*,譚江東

1 浙江師范大學生態研究所, 金華 321004 2 浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室, 金華 321004

自然種群的遺傳變異受諸多因素的影響,如自然選擇、突變、遺傳漂變和種群瓶頸等。島嶼和大陸環境存在明顯的差異,島嶼數量多,且存在地理隔離,島嶼上的物種相對較少,其活動空間范圍較大,遷移率較低等,常被生態學家和進化生物學家視為研究生物進化的“天然實驗室”[1]。島嶼在空間上可以直接確定種群或群落的邊界,為物種進化的研究提供了重復性高的便利場所。因此,在研究自然種群微進化過程中,島嶼常被選作熱點地區。關于島嶼自然種群的遺傳變異也越來越多地受到科學家們的關注[2]。

了解島嶼距離隔離和島嶼面積如何影響野生種群的遺傳變異一直是保護生物學的一個主要焦點[3]。根據中性瓶頸理論,較大且較年輕的島嶼比較小的老的島嶼保留更多的核遺傳變異。劉軍等對千島湖3個島嶼社鼠(Niviventerconfucianus)種群的研究發現,遺傳多樣性與島嶼面積有顯著的正相關關系[4]。Hursto等研究了海島歷史對壁蜥(Podarciserhardii)線粒體和核基因多樣性的影響,結果得出種群特有的遺傳分化指數與島嶼面積呈負相關,表明較小的島嶼具有較大的漂移敏感性[5]。線粒體單倍型的空間分布反映了歷史上的碎裂格局,而不是地理上的接近。小島嶼種群一般更容易受到遺傳漂變和近交的影響,會導致這些種群的遺傳變異和適應度降低。此外,孤島種群可能由于漂移或不同的生態位選擇而產生種群差異[6]。

舟山群島位于浙江省東北部的東海海域,為天臺山脈向東海延伸的余脈,與寧波的北侖相鄰,是中國第一大群島[7]。舟山群島原本與大陸相連,自晚更新世紀以來,經歷了不同程度的海侵(3次)和海退(2次),最終徹底暴露,成為如今的群島。共由1390個不同的島嶼組成,陸地總面積為1440 km2。島嶼大小不等,最小0.63 km2(洛迦山島),最大502 km2(舟山本島)[8]。舟山群島屬北亞熱帶季風海洋性氣候,年均氣溫為15.6—16.6℃,年均降水量為850.6—1367.1 mm,海拔最高為544.5 m[9]。島上分布的嚙齒動物主要有黃毛鼠(Rattuslosea)、黑線姬鼠(Apodemusagrarius)、中華姬鼠(A.draco)、小家鼠(Musmusculus)、社鼠(Niviventerconfucianus)等。其中,黃毛鼠是舟山群島的優勢屬種,隸屬于嚙齒目(Rodentia),鼠科(Muridae),大鼠屬(Rattus)[10]。目前,關于黃毛鼠的研究主要集中于鼠害防治[11,12]、種群生態[13]、年齡結構[14]和交配行為[15]等,關于該物種在島嶼生境中種群遺傳變異及微進化方面的研究尚未見報道。

隨著分子標記技術的成熟,越來越多的學者利用該技術來進行物種鑒定和遺傳變異的深入研究。線粒體DNA具有結構簡單、母系遺傳、幾乎不發生重組和進化速度較快等特點,是研究動物種群遺傳學的理想分子標記[16,17]。因此,本文探討島嶼特征對黃毛鼠種群動態和遺傳分化的影響,利用線粒體DNA D-loop序列,研究舟山群島黃毛鼠種群的遺傳多樣性和遺傳結構,并分析了遺傳距離與島嶼間地理距離、遺傳多樣性與島嶼面積的相關性,為黃毛鼠種群的微觀演化和島嶼物種的進化理論等提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣地及實驗材料

在舟山群島選取地理位置相對集中的8個島嶼,分別為大摘箬山、小摘箬山、刺山島、小貓島、小盤峙島、大貓島、六橫島及桃花島,這些島嶼面積大小不一(0.14—93.66 km2)[18],島嶼間的距離范圍是0.5—20.9 km(根據GPS定位的經緯度計算獲得島嶼間地理距離)。采樣島嶼的具體位置和實驗樣本量見圖1和表1。島上的植被較為豐富,主要植被類型為常綠闊葉林,珍稀優良樹種有紅楠、青岡、黃檀、合歡等[9,19]。

分別于2013年6月和9月、2016年6月用夾捕法在8個島嶼上共采集黃毛鼠樣本361只,由于個別樣本PCR擴增失敗,實際用于數據分析的樣本有330只。取適量的黃毛鼠肌肉組織,放入95%的酒精中固定保存,帶回實驗室,于-70℃保存備用。

圖1 采樣島嶼分布圖Fig.1 Map of the sampled islands 1.小盤峙島;2.刺山島;3.大貓島;4.小貓島;5.大摘箬山;6.小摘箬山;7.桃花島;8.六橫島

1.2 DNA的提取及PCR的擴增

肌肉組織基因組DNA的提取參照鮑毅新等改進的方法[20]。

用于擴增mtDNA D-loop序列的引物參考文獻報道[21],上游引物DF：5′-GTCAACTCCCAAAGCTGAAA TTC- 3′,下游引物DR：5′-TCTCGAGATTTTCAGTGTC TTGCTTT- 3′,由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴增體系如下：10×Burffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+1.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL,5 U/mLTaq酶0.2 μL,DNA模板40 ng,上下游引物各0.5 μL,加雙蒸水至25 μL。反應程序為：95℃預變性5 min,95℃變性30 s,50.9℃退火,72℃延伸35 s。以上步驟設40個循環,72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產物在ABI 3730測序儀中進行雙向測序,此部分工作在生工生物工程(上海)有限公司完成。

表1 樣本采集島嶼信息及黃毛鼠樣本數

1.3 數據分析

使用軟件Arlequin 3.11計算種群間的遺傳分化指數(Fst),并進行分子方差分析(AMOVA)[22];運用Mega 5.05進行DNA序列的比對,計算單倍型的核苷酸中各堿基比例、發生突變的堿基位點,并繪制基于Nei′s遺傳距離的系統發育樹[23]。用NETWORK 5.0.0.0對mtDNA D-loop單倍型進行網絡關系分析。使用DNA SP 5.0計算各種群的多態性位點數、單倍型的數目及其多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數,并進行Tajima′s D中性檢驗(重復次數1000)[24]。利用Mental檢驗分析遺傳距離與地理距離之間的關系[25];使用SPSS 20.0對遺傳多樣性與島嶼面積的相關性進行分析,用Origin Pro 8.0制圖。島嶼面積及島嶼間距離均進行了對數轉換。

2 結果

2.1 遺傳多樣性

舟山群島8個不同島嶼的黃毛鼠種群線粒體D-loop區單倍型和核苷酸多樣性分析如表2所示。不同島嶼種群內D-loop區序列的單倍型多樣性指數(Hd)范圍為0—0.6411,平均值為0.3635(計算時考慮插入/缺失位點),其中大摘箬山種群的單倍型多樣性最高。種群內核苷酸多樣性指數(Pi)范圍為0—0.0024,平均值為0.0013。平均核苷酸差異數(K)在各島嶼種群內的范圍為0—2.5563,平均值為0.9400。多態位點數為0—11個,單倍型數量為1—6個。Pi、K值最高的是小盤峙黃毛鼠種群,最低的是小貓黃毛鼠種群和小摘箬山黃毛鼠種群。根據以上結果來看,舟山群島的黃毛鼠種群具有較低的遺傳多樣性。

表2 不同島嶼黃毛鼠種群的遺傳多樣性參數

2.2 線粒體D-loop區序列分析

對舟山群島8個地理種群黃毛鼠的總DNA進行PCR擴增,產物進行測序,BLAST比對,獲得330條特異性的線粒體D-loop基因片段。經Mega同源比對,去除部分端部序列,最終選取長度為815 bp的線粒體D-loop區序列進行遺傳變異分析。在330條815 bp的D-loop基因片段共發現14個變異位點(表3),其中轉換位點7個,顛換位點3個(A-C,A-T/C,T-A),未發現同時具有轉換和顛換的位點,而插入/缺失位點4個,分別為：84,164,632,633位點,插入/缺失多樣性為1.508,插入/缺失單倍型6個,插入/缺失單倍型多樣性為0.718。330條mtDNA D-loop基因序列核苷酸堿基組成顯示A,T,C,G含量分別為32.9%,29.0%,25.1%,13.0%,其中G的含量顯著低于其他堿基的含量,是mtDNA的一個顯著特征[26],A+T含量(61.9%)大于G+C(38.1%)的含量,符合哺乳動物A,T含量高,G,C含量低的特點[27]。

表3 黃毛鼠種群 D-loop序列基因的單倍型及變異位點

垂直數字表示多態性位點的核苷酸位置,“-”表示缺失

8個黃毛鼠種群330條mtDNA D-loop序列共檢測出15個不同的單倍型,單倍型序列號為：KY054815—KY054829。其中Hap 1分布最為廣泛,在5個種群中出現,六橫島黃毛鼠種群有6個單倍型,其中Hap 9、Hap 10、Hap 14、Hap 15只在該種群樣本中檢測到。大貓島黃毛鼠種群與小貓島黃毛鼠種群共享Hap 3;大摘箬山黃毛鼠種群、桃花島黃毛鼠種群和六橫島黃毛鼠種群共享Hap 5,小摘箬山黃毛鼠種群和刺山島黃毛鼠種群共享Hap 2;Hap 4,Hap 7,Hap 8,Hap 9,Hap 10,Hap 11,Hap 12,Hap 13,Hap 14,Hap 15為特有單倍型。單倍型Hap 1,Hap 2,Hap 3,Hap 5,Hap 6共享的個體數在30以上,為優勢單倍型(表4)。

表4 D-loop序列基因單倍型在黃毛鼠種群中的分布

2.3 遺傳分化分析

遺傳分化指數(Fst)是反映種群進化歷史的重要參數,可以在一定程度上揭示種群間基因流和遺傳漂變的程度,而基因流則可以反映出群體間可能存在基因滲透現象[28]。由表5得知,黃毛鼠群體間的遺傳分化指數范圍是0.100—0.9629,平均值為0.7450;基因流的范圍是0.0096—2.2500,平均值為0.4076。小貓島黃毛鼠種群與六橫島黃毛鼠種群間的基因流最小,分化程度最高;小貓島黃毛鼠種群與小摘箬山黃毛鼠種群間基因流最大,分化程度最低。

表5 黃毛鼠種群間遺傳分化系數Fst(下三角)與基因流Nm(上三角)

分子方差分析(AMOVA)結果顯示,黃毛鼠不同種群間遺傳變異的比例最大,為74.50%,而種群內的遺傳變異為25.50%,說明黃毛鼠種群D-loop區序列的變異主要來源于種群間(表6)。

表6 黃毛鼠種群D-loop序列遺傳變異的分子方差分析

2.4 系統發生樹

根據330只黃毛鼠樣本的mtDNA D-loop序列計算遺傳距離并構建N-J系統發生樹(圖2)。結果顯示8個黃毛鼠種群聚為2類,刺山島黃毛鼠種群、大貓島黃毛鼠種群、小貓島黃毛鼠種群、小摘箬山黃毛鼠種群、大摘箬山黃毛鼠種群和小盤峙島黃毛鼠種群等6個島嶼的黃毛鼠種群聚為一支,而六橫島黃毛鼠種群和桃花島黃毛鼠種群2個島嶼的黃毛鼠另聚為一支。

圖2 基于遺傳距離構建的N-J系統發育樹Fig.2 N-J phylogenetic tree constructed by genetic distance

圖3 基于15個單倍型構建的N-J系統發生樹 Fig.3 Phylogenetic tree of 15 haplotypes using the neighbor-joining (NJ)

根據黃毛鼠mtDNA D-loop序列的15個單倍型,構建N-J系統發生樹(圖3)。結果顯示15個單倍型明顯分為2支,上支含8個單倍型,分布于87只黃毛鼠個體,占總數的26.36%,下支含7個單倍型,分布于243只黃毛鼠,占總數的73.64%。

用NETWORK5.0.0.0對舟山群島8個黃毛鼠種群的15個mtDNA D-loop單倍型進行網絡關系分析(圖4),結果從缺失單倍型明顯分隔成兩支,與15個mtDNA D-loop單倍型的系統發生樹結果一致,這說明舟山群島8個黃毛鼠種群可能起源于兩個母系。

2.5 相關性分析

通過Mental檢驗分析發現,遺傳分化指數與不同島嶼種群間的地理距離(取對數)之間存在顯著正相關關系(r=0.6077,P=0.004)(圖5)。單倍型多樣性與島嶼面積(取對數)之間無顯著相關性(r=0.6255,P=0.1840)(圖6)。

圖4 mtDNA D-loop區單倍型網絡結構圖Fig.4 The haplotypes network of D-loop partial sequence

圖5 黃毛鼠種群間遺傳距離與島嶼間地理距離相關性 Fig.5 Relationships between genetic distances of Rattus losea populations and geographic distances

圖6 黃毛鼠種群單倍型多樣性與島嶼面積的相關性 Fig.6 Relationship between haplotype diversity of Rattus losea populations and island areas

3 討論

3.1 遺傳多樣性

基于線粒體DNA的分析,8個島嶼的黃毛鼠種群單倍型和核苷酸多樣性指數分別為0.3635和0.0013,顯著低于同屬其他嚙齒動物。如丁雪梅等對云貴高原銀星竹鼠(Rhizomyspruinosus)的遺傳多樣性研究結果顯示,種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.7120和0.0026[29],是黃毛鼠種群的兩倍。青藏高原上的嚙齒動物類群遺傳分化更加明顯,單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較高,如中華姬鼠(Hd=0.9890,Pi=0.0368)[30]、青藏高原高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)(Hd=0.9640,Pi=0.0530)[31]。黃毛鼠種群較低的遺傳多樣性可能與它的生活習性、擴散遷移能力、生境的變化以及地理上的隔離密切相關[30- 33]。但島嶼種群主要是受地理隔離的影響,限制了各種群間的基因交流,從而出現顯著的群體地理分化格局。同時本研究發現島嶼面積相近的三個種群中,刺山島黃毛鼠種群的遺傳多樣性高于小貓島黃毛鼠種群和小摘箬山黃毛鼠種群,推測這可能與種群的大小有關,低的遺傳變異常常出現在小種群中[34,35]。對其他物種的研究中也證實了這一點,如在紅番硨磲貝(Tridacnacrocea)的研究中表明,大的種群將比小的種群積累更多變異[36]。用分子標記對野外小鼠研究時,發現遺傳變異受到少量局部樣本的限制[37,38]。同樣,使用不充分的樣本進行種群研究,會對嚙齒動物的種內遺傳結構和系統發育關系的評估造成影響[39-40]。因此,認為刺山島黃毛鼠種群的遺傳多樣性高于其他兩個面積相近種群,可能受到種群大小的影響,刺山島種群數量較大,故具有較高的遺傳多樣性。綜上所述,地理隔離和種群大小對種群的遺傳多樣性有較大影響。

3.2 遺傳結構

遺傳分化指數是檢測群體分化程度的重要指標[41]。Wright研究認為,若Fst< 0.05,則表示種群間存在很小的遺傳分化;若0.05 0.25,則表示種群間具有非常高的分化程度[42]。本研究結果顯示黃毛鼠種群間的遺傳分化指數平均值為0.7450,處于非常高的分化水平。基因流是種群遺傳結構均質化的主要因素之一,具有較高水平基因流的種群間往往比具有有限基因流的種群間的遺傳分化程度小[43]。通常認為,Nm < 1時,表明群體間基因流的水平低,種群可能因為遺傳漂變而發生了分化;Nm > 4時,則說明種群間存在著較強的基因流,起到勻質化作用,在相當程度上阻礙了種群間的遺傳分化[28]。Manel等也指出島嶼地理隔離阻礙基因的交流[44]。本研究中, 不同島嶼黃毛鼠種群間Nm大部分小于1,4個種群間的Nm大于1,表明黃毛鼠地理種群間基因交流很弱,產生明顯遺傳分化。AMOVA分析,結果顯示黃毛鼠的遺傳變異主要來自于種群間,也進一步表明種群間的基因交流并不頻繁,遺傳分化程度較高。這種遺傳結構不僅與黃毛鼠有限的遷移擴散能力有關,也與島嶼生境有關。舟山群島的島嶼生境屬于片段化生境類型,阻礙了種群之間的交流。舟山群島上的其他物種,如獐,也由于島嶼間的隔離產生較高的遺傳分化[41]。因此,隔離度對島嶼種群的遺傳結構發揮著重要作用,島嶼間隔離度越大,種群間分化程度越高。

330個黃毛鼠樣本中15個mtDNA D-loop的單倍型序列構建系統發生樹和網絡關系結果表明,舟山群島8個島嶼的黃毛鼠種群可能具有兩個母系起源,地理距離較近的刺山島、大貓島、小貓島、小摘箬山、大摘箬山和小盤峙島6個島嶼的黃毛鼠種群為同一起源,而六橫島和桃花島相距較近,其上的黃毛鼠種群起源于另一支母系,顯示出種群間遺傳分化和地理分布有明顯的相關性。本研究對所有單倍型進行中性檢驗,當Tajima′s D > 0時,可以推斷瓶頸效應和平衡選擇;當Tajima′s D < 0時,可以推斷群體規模放大和定向選擇[45]。本文結果中Tajima′s D值除小盤峙島種群外,均為負值,且差異極顯著。說明遺傳結構偏離中性假說,支持黃毛鼠種群受到自然選擇作用,歷史上發生過群體擴張事件。

3.3 島嶼間地理距離、面積大小與遺傳變異的相關性分析

近年來,很多研究采用分子標記方法研究物種間遺傳分化程度與地理距離之間的關系。有的認為二者間有顯著相關性,即地理距離越大,遺傳分化程度越高,也有結論得出它們之間的相關性并不十分明顯。兩者之間是否存在相關性與物種的活動能力和活動范圍有關。如活動能力強的鳥類的遺傳分化程度比活動能力弱的哺乳類和兩棲類的低,因為它們所受到的隔離效應相對較小;而對小哺乳動物而言,即使種群間地理距離非常小,也可能會產生明顯的遺傳分化。Spiridonova等對小家鼠種群進行研究分析,結果發現雖然地理距離較小,但種群間存在明顯遺傳分化[46]。黃毛鼠的擴散能力相對較弱,因此更易受到地理隔離的影響,島嶼間的地理距離和種群間的遺傳距離存在顯著正相關關系,符合距離產生分化的理論模型,故種群間的交流受到了島嶼隔離限制。Manel等也對島嶼環境下的種群基因流進行了分析,研究發現島嶼間地理的隔離是導致種群遺傳高度分化的主要因素[44]。而且棲息地的片段化或地理隔離規模越大,種群的遺傳分化會越顯著[47]。

生境片段化后會產生“面積效應”,即適合物種生存的面積減小,導致種群的遺傳多樣性降低[48-49]。特別是對于島嶼物種,島嶼面積越大,生境異質性越高,導致遺傳漂變程度和資源競爭強度降低,因此島嶼面積與種群遺傳多樣性存在正相關關系[50]。有大量研究證實了這一點,對千島湖島嶼生境中的黑腹狼蛛(Lycosacoelestris)和社鼠種群的研究結果表明,島嶼面積與種群的遺傳多樣性之間都有顯著相關性[51,52]。而在本研究中,去除面積相差太大的六橫島黃毛鼠種群和桃花島黃毛鼠種群外,其余6個島嶼的黃毛鼠種群遺傳多樣性與島嶼面積之間無顯著相關性,但表現出面積大的島嶼遺傳多樣性較高的趨勢,大貓島面積最大,遺傳多樣性較高,小貓島和小摘箬山島面積較小遺傳多樣性最低。小面積島嶼上黃毛鼠種群面臨外界的干擾相對強烈,適合個體生存的生境減小,種內競爭增強,種群處于不穩定狀態,這可能是舟山島嶼環境下總體黃毛鼠種群遺傳多樣性較低的原因。

綜上,本研究以島嶼生境作為研究平臺,發現舟山群島黃毛鼠種群具有較低的遺傳多樣性與較高的分化水平,且主要是受到了地理隔離的影響,地理隔離對種群變異發揮著重要作用。8個島嶼種群主要分為兩支,距離相近的優先聚為一支。遺傳距離與地理距離之間存在顯著正相關關系,也進一步證明了地理隔離對島嶼種群的遺傳結構具有重要影響。今后還需對黃毛鼠島嶼種群與大陸種群進行比較,判斷其是否符合島嶼法則,并從形態變異方面研究黃毛鼠種群的微進化。