不同土地利用方式下酚酸物質與土壤微生物群落的關系

及 利, 楊雨春, 王 君, 楊立學

1 森林生態系統可持續經營教育部重點實驗室，東北林業大學林學院，哈爾濱 150040 2 吉林省林業科學研究院, 長春 130033

土地利用是人類干預土壤質量最重要、最直接的活動,它長期持續地改變著土壤結構、養分以及土壤生物的代謝活動,進而使土壤供應植物的營養水平發生變化[1]。土地利用的變化對陸地生態系統的生物地球化學循環進程有重要的影響[2- 4],土地利用方式的改變影響著土壤養分的循環與供應,直接造成土壤質地和地下微生物群落結構的變化,調整著陸地生態系統的結構與功能[5- 7]。

土壤微生物對土地利用的變化十分敏感,Potthast等[8]通過對厄瓜多爾南部地區森林、放牧草原和撂荒地的比較分析發現,森林和撂荒地的微生物活性較低,草原的微生物量碳含量為3445 mg/kg,是森林和撂荒地的3倍以上。Tischer等[9]認為土地利用方式和土層深度對微生物生態化學計量有顯著的影響,相比與微生物碳∶氮(C∶N),隨著土層深度增加,微生物氮∶磷(N∶P)和碳∶磷(C∶P)有顯著升高的趨勢。Song等[10]發現與原始森林相比,次生林和人工林的真菌、細菌和總微生物量有顯著降低的趨勢,植被群落和土壤制度的差異導致了微生物群落的變化。土壤干擾對微生物群落結構有重要的影響,未割草的休耕地下的微生物PLFA濃度高于割草處理和撂荒地的,與施肥相比,土地利用方式對微生物生物量和群落結構有更顯著的影響,休耕地下的革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌(G+/G-)和真菌/細菌(F∶B)顯著高于4種施肥處理[11]。

通過地上植被的皆伐和火燒等措施,在土地利用方式的轉變或森林植被類型的轉換過程中伴隨著土壤養分的遺留作用,該作用也影響著地下微生物的變化,與植被和土壤質量相比,土地利用歷史對微生物有著更加顯著的影響[12- 14]。在一定程度上,養分遺留造成的變化與植物合成存留在土壤中的次生代謝產物對微生物的影響有關。酚酸物質不僅對植物生長有促進或抑制作用,而且對微生物的分布區系也有顯著影響[15- 19]。Qu和Wang[20]通過向大豆土壤施加2, 4-二叔丁基苯酚和香草酸,發現酚酸處理后對真菌有顯著影響而對細菌則只有輕微的變化。Stringlis等[21]發現具有抗菌活性的根系分泌物香豆素調控微生物群落的變化,抑制病原體尖孢鐮刀菌及黃萎病菌的生長。Zhou等[22]認為p-香豆素能分別降低和增高細菌和真菌群落的多樣性,能夠抑制有利于植物生長的微生物的生長,如Lysobacter,Haliangium和Gymnoascusspp.。然而,大多數研究在酚酸與微生物群落之間的關系方面只關注于室內試驗添加外源酚酸的研究,而野外自然條件下酚酸與微生物群落的關系卻鮮見報道。及利等[23]發現采煤沉陷區不同樹種恢復造林過程中,阿魏酸、松香酸和β-谷甾醇對微生物量有明顯的促進作用,與真菌和真菌/細菌(F∶B)存在顯著正相關關系。

眾多學者研究了不同土地利用方式條件下微生物群落結構與土壤酶、土壤養分生態化學計量、pH的關系[24- 27],而由于根系分泌、凋落物分解和地上淋溶等作用產生的土壤酚類物質與微生物群落結構的關系還鮮見報道。凋落物和根系分泌物對微生物提供碳源,細菌和真菌將其分解,間接地改變了土壤pH和養分比例,尤其是C∶N。因此,地假設不同土地利用方式中的土壤酚類物質與土壤微生物的相關程度密切。本研究旨在探究四種不同土地利用方式下不同形態的土壤酚類物質和9種具體的酚酸物質與土壤微生物之間的關系,為酚類物質在土壤中的作用以及對微生物的影響提供依據,以期為更好地理解土地利用方式變化對微生物群落影響的作用機制提供一定的理論基礎。

1 研究地區與研究方法

1.1 研究區概況

研究地點位于龍江森林工業集團總公司山河屯林業局奮斗林場(127°22′—127°24′E,46°21′′—46°37′N)。該地區地處中溫帶大陸性季風氣候區,冬季干燥寒冷,夏季溫潤炎熱,年平均氣溫在2.7—3.0℃之間,極端最低氣溫-42℃,極端最高氣溫36℃,平均年降水量達600—800 mm,無霜期110—128 d,土壤類型為Hap-Boric Luvisol[28]。

1.2 試驗設計及取樣方法

2014年7月中下旬,在奮斗林場試驗地選擇立地條件一致的次生林(SF)、20年生落葉松純林(LP)、農田地(FL)、撂荒地(AL),每個土地利用方式內分別設置3個20 m ×30m的樣方,各樣方自距離不超過1000 m(表1)。樣方四角用木樁做好標記,便于取樣。次生林的主要喬木樹種有蒙古櫟(Quercusmongolica)、水曲柳(Fraxinusmandschurica)、落葉松(Larixgmelinii)、紅松(Pinuskoraiensis)、春榆(Ulmusdavidianavar.japonica)等,主要灌木為暴馬丁香(Syringareticulatavar.amurensis)、山荊子(Malusbaccata)、茶條槭(Acerginnala)、色木槭(Acermono)、稠李(Padusracemosa)等,主要草本為東北茶藨子(Ribesmandshuricum)、水金鳳(Impatiensnoli-tangere)、木賊(Equisetumhyemale)、蚊子草(Filipendulapalmata)等;落葉松人工林林分密度為1300 株/hm2,主要草本為雞樹條莢蒾(Viburnum sargenti Koehne)、水金鳳(Impatiensnoli-tangere)、木賊(Equisetumhyemale)、懸鉤子(Rosarubus)等。農田地主要種植玉米,耕作超過10年以上。撂荒地撂荒超過5年以上,無喬木和灌木生長,主要草本為水金鳳(Impatiensnoli-tangere)、木賊(Equisetumhyemale)懸鉤子(Rosarubus)等。4種土地利用方式的坡度均在5—10°之間。

2014年8月初,在每個樣方內隨機選取5個樣點,用土鉆取0—5 cm、5—10 cm和10—20 cm層的土樣(土鉆口徑×深度為10×20 cm),裝于自封袋中放入便攜式冰箱中低溫保存運回(FD- 1A- 50 Boyikang Experiment Instruments Co., Beijing)。將取得的部分土樣過2 mm篩(10目)后凍干,之后置于-80 ℃冰箱保存,用于測定磷脂脂肪酸種類和含量;將部分土樣風干,用于酚類物質以及酚酸物質含量的測定。

1.3 酚類物質的測定

土壤總酚、復合態酚和水溶性酚含量的測定參照葉發茂[29]的方法使用福林酚法測定。

表1 4種不同土地利用方式的主要特征(0—20 cm層)

不同字母代表差異顯著(P<0.05)

1.4 9種酚酸物質含量的測定

樣品的測定采用高效液相色譜法(HPLC),高效液相色譜儀為Agilent 1200,色譜柱為Zorbax SB-C18反相柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),土壤中不同物質的HPLC檢測條件和檢測方法不盡相同,根據相關文獻的記載和實踐驗證[23],綜合得出改進后的方法分別測定阿魏酸、2,4-二羥基苯甲酸、間苯三酚等9種酚酸物質(表2)。

1.5 磷脂脂肪酸(PLFA)的測定

土壤微生物群落采取磷脂脂肪酸(PLFA)方法進行測定。磷脂脂肪酸的提取方法主要參照Frostegard的方法[30]。測試儀器為氣象色譜質譜聯用儀(GC-MS, Varian 450-GC and Varian 240-MS),GC條件：石英毛細管柱DB- 5(30 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm),柱溫60℃。每種處理稱取1 g土樣,樣品提取所用溶劑均為分析純,十九酸甲酯標準品購于美國AccuStandard有限公司,所有玻璃器皿使用前用正己烷潤洗。

通過將標準物質十九酸甲酯的相對保留時間及質譜圖與數據庫中進行對比,來確定PLFAs的含量。PLFAs的定量由內標法確定。脂肪酸12:0、14:0、15:0、16:0、17:0、18:0、20:0、i15:0、a15:0、i17:0、10Me18:0、16:1ω7、16:1ω9c、18:1ω9、cy17:0、cy19:0代表細菌[31,32],18:lω9c,18:1ω9代表真菌[33,34]。

1.6 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS19.0軟件處理數據。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗不同處理之間的差異(LSD,α=0.05)。線性方程擬合采用逐步回歸法;相關分析采用Pearson法(雙側檢驗)。應用Canoco for Windows 4.5軟件對酚酸物質與土壤微生物間的關系進行冗余分析(Redundancy analysis,RDA),用R語言vegan包分析酚酸物質對微生物群落的貢獻。在SigmaPlot 12.0軟件中作圖。所有數據為平均值±標準誤。

表2 9種酚酸物質的HPLC測定條件

X: 酚酸物質的濃度 Concentration of phenolic acids;Y: 峰面積 Peak area

2 結果與分析

2.1 不同土地利用方式下土壤酚類物質和酚酸物質的變化特征

不同土地利用方式之間的土壤總酚和水溶性酚含量存在顯著差異(圖1,P<0.05)。落葉松人工林土壤各土層的總酚含量最高(P<0.05),0—5 cm層中,分別比次生林、農田地和撂荒地高44.88%、63.62%、112.01%。在0—5 cm和5—10 cm層中,落葉松人工林土壤水溶性酚含量顯著高于其余三種土地利用方式(P<0.05),而在10—20 cm層中,則是次生林最高(P<0.05)。總體上,隨著土層深度的加深,四種土地利用方式下土壤總酚和復合態酚含量呈逐漸降低的趨勢。

圖1 不同土地利用方式下土壤總酚、復合態酚和水溶性酚含量的垂直分布 Fig.1 The vertical distribution of soil total phenol, complex phenol and water-soluble phenol content under different land uses不同字母代表差異顯著(P<0.05);SF、LP、FL和AL分別代表次生林、落葉松人工林、農田地和撂荒地

4種土地利用方式下,9種酚酸物質含量差異顯著(P<0.05,表3)。總體上,間苯三酚、莽草酸、肉桂酸和β-谷甾醇在各種土地利用方式中的含量較高。在0—5 cm層中,β-谷甾醇在次生林中的含量最高且顯著高于其他三種土地利用方式,香豆素和肉桂酸在農田地中的含量最高且顯著高于撂荒地,松香酸在撂荒地中的含量最高,撂荒地中松香酸的含量顯著高于其他土地利用方式。

總體上,隨著土層深度的加深,阿魏酸、2,4-二羥基苯甲酸、香豆素、β-谷甾醇和莽草酸的含量呈逐漸減小的趨勢,而肉桂酸在不同土層深度之間則變化不明顯,齊墩果酸含量表現為先降低后升高的趨勢;隨著土層的加深,松香酸含量在次生林中表現為先升高后降低,在落葉松和農田地中的表現為先降低后升高,在撂荒地表現為持續降低的趨勢;間苯三酚的含量在天然林表現為逐漸降低的趨勢,在落葉松和農田地表現為先降低后升高,在撂荒地則表現為先升高后降低的趨勢(表3)。

2.2 不同土地利用方式下土壤微生物群落的變化

土地利用方式對土壤微生物群落存在顯著影響(圖2,P<0.05)。在0—5 cm層,落葉松人工林的總PLFA、細菌和真菌含量分別為105.80、91.02和9.43 nmol/g,顯著高于農田地和撂荒地(P<0.05),而F∶B則是次生林最大,顯著高于其余三種土地利用方式(P<0.05)。在5—10 cm層中,次生林的土壤總PLFA和細菌群落顯著高于落葉松人工林,分別高135.23%和131.59%(P<0.05)。總體上,隨著土層深度的加深,次生林和落葉松人工林的真菌和F∶B呈逐漸降低的趨勢。

2.3 土壤酚類物質與土壤微生物群落的相關性

土壤總酚和水溶性酚與土壤微生物群落存在顯著的相關關系(P<0.05,圖3)。在0—5 cm層中,土壤總酚與總PLFA和細菌含量極顯著正相關(P<0.01),與真菌含量顯著正相關(P<0.05),而在0—5 cm層土壤中的復合態酚和水溶性酚與各微生物類群均不存在相關性。在5—10 cm層中,土壤總酚和水溶性酚與總PLFA和細菌群落均呈極顯著的負相關關系(P<0.01),且水溶性酚與微生物群落的相關性要高于總酚的。總體上,0—10 cm層土壤中的酚類物質與微生物聯系密切,而10—20 cm的深層土中酚類物質并不起主要作用。

表3 四種土地利用方式下不同土層中9種酚酸物質含量/(μg/g)

不同字母代表差異顯著(P<0.05)

圖2 不同土地利用方式下土壤微生物含量的垂直分布Fig.2 The vertical distribution of soil microbial content under different land uses嵌入的圖表示4種土地利用方式下真菌：細菌

圖3 土壤總酚、復合態酚和水溶性酚與土壤微生物群落的線性回歸分析Fig.3 The linear regression analysis between soil microbial community and soil total phenol, complex phenol, water-soluble phenol respectively

2.4 9種酚酸物質與土壤微生物群落的相關分析

分別對0—5 cm層和10—20 cm層的土壤PLFA與土壤酚酸物質進行冗余分析,把各土層中的9種酚酸物質與微生物群落做偏蒙特卡洛檢驗,每個土層的兩個排序軸均解釋了總變異的90%以上,說明這兩個排序軸在某種程度上能反映酚酸物質對微生物群落影響的大部分信息(圖4)。但不同酚酸物質在不同土層之間的表現不同,其中,在0—5 cm層中,阿魏酸、2,4-二羥基苯甲酸和β-谷甾醇與真菌和F∶B呈顯著正相關關系(P<0.05),在10—20 cm層中,β-谷甾醇與F∶B存在顯著正相關關系(P<0.05)。

圖4 土壤酚酸物質與土壤微生物群落的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of soil phenolic acids and soil microbial communitiesFer.: 阿魏酸Ferulic acid; 2,4-dihy.: 2,4-二羥基苯甲酸2,4-dihydroxybenzoic acid; 7-hycou.: 7-羥基香豆素7-hydroxycoumarin; Abi.: 松香酸Abietic acid; β-sit.: β-谷甾醇β-sitosterol; Ole.: 齊墩果酸Oleanolic acid; Shi.: 莽草酸Shikimic acid; Cin.: 肉桂酸Cinnamic acid; Phl.: 間苯三酚Phloroglucinol

土壤酚酸物質與微生物群落的Pearson相關分析表明,不同種類酚酸物質對土壤微生物群落的影響程度不同,同一種酚酸物質在不同土層之間對微生物的作用也存在明顯差異(表4)。其中,在0—5 cm層中,阿魏酸、2,4-二羥基苯甲酸和齊墩果酸與總PLFA、細菌和真菌群落存在顯著的正相關關系,且阿魏酸對真菌群落的影響較大(P<0.01);在10—20 cm層中,酚酸物質與微生物群落不存在明顯的相關關系,只有β-谷甾醇與F∶B達到顯著正相關的水平(P<0.05)。本研究在5—10 cm層的酚酸物質均不顯著,且通過冗余分析的結果,10—20 cm層的大部分酚酸并未發揮主要作用。

3 討論

由于地上植被群落、地表凋落物分解速率和人為活動干擾程度等方面存在差異,土地利用方式改變了固有的土壤微生物群落區系[10,12,27,35-37]。本研究中,0—5 cm層中,SF的總PLFA和真菌含量顯著高于FL和AL,而在5—10 cm層和10—20 cm層中則未達到顯著水平,而0—5 cm層中,AL的細菌群落含量顯著低于SF和LP(P<0.05, 圖2),這說明土地利用方式的變化對表層土壤微生物群落的改變有顯著作用,而對亞表層土壤則影響較小。Zhang等[38]人研究表明,在次生林向落葉松人工林轉變過程中,由于土壤酸化和有效養分含量的降低,土地利用方式對土壤表層(0—10 cm層)微生物群落影響較大。我們發現0—5 cm層中,林地的F∶B顯著高于FL和AL(P<0.05, 圖2),這可能是與不同土地利用方式下的養分轉換和歸還、林地的枯枝落葉質量和數量比耕地和荒地高有關,這與眾多學者研究結果吻合[26,27,39]。同時,土壤干擾對微生物群落結構有重要的影響,F∶B能快速地對土地管理制度的變化做出快速的反應,其比值越高,生態系統越穩定,同時氮的流失速率降低[40]。Bailey等[39]認為經過耕作的土壤與自然管理或未耕作的土壤相比,有更低的真菌含量。

表4 9種酚酸物質與土壤微生物群落的Pearson相關分析

**P<0.01; *P<0.05

通過植物和草食動物取食等產生的次生代謝物質影響著植物與土壤、地上與地下的交互作用,尤其是影響微生物的代謝活動,酚類物質是土壤中重要的次生代謝產物之一,對土壤中的養分轉換和循環以及微生物群落結構產生影響[15,41]。本研究中,0—5 cm層的土壤總酚與土壤總PLFA、細菌和真菌群落均達到顯著正相關關系,而5—10 cm層中,土壤總酚和水溶性酚均與土壤總PLFA和細菌群落存在顯著負相關關系(P<0.05, 圖3),這是因為由于地表凋落物分解作用,表層土壤的酚類物質含量遠高于深層土壤的,而土壤酚類物質對土壤有效養分和土壤酶活的變化性有重要作用,進而對土壤微生物群落產生影響[42]。酚類物質能抑制與土壤硝化作用有關的微生物類群,降低土壤硝化作用的強度[43],Blum[44]發現在營養充足的條件下,酚酸容易被微生物利用表現出自毒作用,從而引起土壤微生物數量密度的改變。林地(尤其針葉林)的腐殖層有大量抑制性化合物,降低凋落物分解速率,減緩土壤團聚體礦化速率,土壤中的酚酸物質可以減少微生物生物量和活動,并改變土壤微生物群落結構[42,45]。Souto等[46]發現挪威云杉產生的酚酸化合物對微生物活動具有一定的抑制作用。本研究中,通過將9種土壤酚酸物質與土壤微生物群落的進行冗余分析發現,四種土地利用方式下0—5 cm層中,土壤的酚酸物質與真菌和細菌群落有密切的關系,且阿魏酸和2,4-二羥基苯甲酸等物質對微生物群落結構有顯著的影響(P<0.05),但在10—20 cm層中,微生物群落與酚酸物質間的關系并不緊密,只有β-谷甾醇與各微生物類群顯著相關(P<0.05, 圖4)。Ji等[47]通過向胡桃楸幼苗添加落葉松林地分泌的2,4-二羥基苯甲酸、阿魏酸、香豆素和松香酸的根際和非根際濃度后,發現非根際處理下的微生物量要高于根際處理下的,群落結構也更加豐富,同時7-羥基香豆素+2,4-二羥基苯甲酸+阿魏酸和7-羥基香豆素+阿魏酸處理下的微生物量要顯著高于對照。酚酸物質可以顯著的影響土壤中微生物的生物量、多樣性和群落組成,能夠增強某種特定種類微生物的豐富度[46-47]。

4 結論

綜上所述,不同土地利用方式下不同種類的酚酸物質含量存在差異,酚酸物質與微生物群落存在密切的關系,相比于10—20 cm層,0—5 cm層土壤真菌和微生物群落結構受酚酸物質作用的影響較大,同時,四種土地利用方式下,0—5 cm層和5—10 cm層的土壤總酚對各群落微生物量的影響分別表現為促進和抑制的作用。我們的研究只關注了在不同土地利用方式下酚類物質和酚酸物質與土壤微生物之間的關系研究,而了解不同土地利用方式下植物碳輸入方式的不同對土壤理化性質和地下微生物群落的影響,有利于進一步揭示微生物群落在土地利用方式下的變化機制,因此,未來可開展相關研究來豐富和完善土地利用對微生物群落的影響機制。