長期氮添加對亞熱帶森林土壤微生物碳源代謝多樣性的影響

刁 嬋,魯顯楷,田 靜,張永清,莫江明,于貴瑞

1 中國科學院地理科學與資源研究所,生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室,北京 100101 2 山西師范大學,地理科學學院,臨汾 041000 3 中國科學院華南植物園,中國科學院退化生態系統植被恢復與管理重點實驗室,廣州 510650

大氣氮(N)沉降是陸地生態系統重要的N輸入過程,對維持生態系統N平衡和生產力至關重要[1]。然而,人類活動加速了N的輸入過程,據估計,過去145年(1860—2005),全球N沉降增加了近3倍,并預計到2050年將達到200 Tg N a-1[2]。大量研究證實大氣N沉降的頻繁輸入會引起土壤呼吸、養分礦化與固定、土壤微生物分解等一系列生態過程不同程度的變化[3- 4]。而這些變化加速又改變著土壤微生物多樣性以及土壤養分循環[5- 6]。

土壤微生物作為土壤生態系統重要的組成部分,推動著生物地球化學循環與轉化,是衡量土壤肥力與健康的關鍵指標[7- 8],因此微生物多樣性對土壤質量及生態系統穩定性具有重要意義。大量研究表明,N沉降會顯著影響土壤微生物量和群落結構[9- 14]。目前研究發現土壤微生物量對N沉降具有增加[11]、減少[12- 13]或不變[14]等3種響應。微生物功能多樣性信息對于明確不同環境中微生物群落的作用具有重要意義[15]。其中以BIOLOG微孔板碳源利用為基礎的定量分析描述了微生物對不同種類碳源的利用多樣性,被證明是研究微生物群落代謝功能多樣性的一種簡單和快速的方法[15]。目前研究發現氮沉降增加會引起土壤微生物對底物的利用模式改變。例如,Johnson等[16]在歐石南叢生的荒地中的研究發現,氮增加造成了微生物對底物的利用率提高了3倍;但在酸性的草地中則相反,土壤微生物對氮增加的響應表現為降低對碳源的利用率。Frey等[12]在美國哈佛森林氮添加實驗發現,闊葉林和混交林土壤微生物對底物的利用率與氮增加并沒有明顯的關系。這些研究的差異性可能和研究區域,施N時間以及各區域的土壤植被環境條件有很大關系[17- 19]。比如研究發現土壤微生物對不同碳源的利用情況對外界環境變化比較敏感,會受到多種生物和非生物因素的影響[15,20- 23]。例如Blagodatskaya等[20]發現pH是影響土壤微生物對碳源的利用活性的重要影響因子。陳法霖等[18]通過對南方紅壤丘陵區的研究發現,針-闊混合凋落物比單一針葉凋落物更有利于提高土壤微生物群落的碳源利用能力。亞熱帶森林作為重要的可再生經濟資源,其對涵養水源、保持水土、溫室氣體預算和維持生物多樣性方面具有非常重要的貢獻[24]。但是隨著經濟社會發展水平的提升,過量的N輸入顯著影響了熱帶和亞熱帶森林的生物地球化學循環,比如土壤酸化、水體富營養化、林蓄積量下降以及P元素限制加劇等一系列問題[25- 26]。雖然近年來N沉降對亞熱帶和熱帶森林生態系統微生物影響的研究越來越多[24,27- 28],但總體上來說研究的時間尺度比溫帶森林短得多。比如,Cusack等[27]以Luquillo試驗林中的熱帶雨林和山地森林為例分析了N添加對土壤微生物群落特征的影響。袁穎紅等[25]探討了福建省杉木人工林中土壤微生物功能多樣性對N添加響應。因此,加強亞熱帶森林生態系統長期N輸入對土壤微生物功能影響的研究,將有助于幫助我們對N、P養分循環等生態系統關鍵過程的調控,以及對森林生態系統功能動態變化的預測。

本研究以鼎湖山季風常綠闊葉林(以下簡稱“季風林”)為研究對象,基于已有的長期野外模擬N沉降試驗樣地平臺,運用Biolog微平板技術研究了長期N添加對土壤微生物碳源代謝多樣性變化的規律,同時探討了微生物碳源代謝多樣性與環境因子之間的相關關系。研究結果可為熱帶森林生態系統應對全球變化提供重要理論依據,同時對于推動森林生態系統可持續發展和加強對其管理和功能調控也具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 樣地概況與設計

本研究位于廣東省中部的鼎湖山自然保護區(112°33′E,23°10′N),屬于亞熱帶季風氣候。年均溫為21.4 ℃,最冷月(1月)和最熱月(7月)的均溫分別為12.6 ℃和28.0 ℃。年均降雨量為1927 mm,約有3/4集中在3—8月。氣溫及降水具有明顯的季節性特征。土壤類型為由泥盆紀厚層變質砂巖、砂頁巖發育而成的不同深度的氧化土(土壤深度超過60 cm)[29- 30]。季風林為本地典型的地帶性植被,其喬木層的主要物種有錐栗(Castanopsischinesis)、荷木(Schimasuperba)、厚殼桂(Cryptocaryachinensis)、黃果厚殼桂(Cryptocaryaconcinna)、華潤(Machiluschinesis)等;而灌木層則以柏拉木(Blastuscochinchinensis)、九節(Psychotriarubra)、光葉山黃皮(Randiacanthioides)等可耐陰植物類型占比較高[30- 31]。建立樣地之初,各小區植被物種組成不存在顯著差異。

該研究區域從1990年以來氮沉降問題日趨嚴重(>30 kg N ha-1a-1),根據觀測,2009—2010年,該區域全年N濕沉降量和干沉降量分別為34.4 kg N hm-2a-1和14.2 kg N hm-2a-1[32]。結合本地氮沉降情況,本研究設計了4個N水平處理[29],分別包括：對照(Control:0 g m-2a-1)、低氮(Low N: 5 g N m-2a-1)、中氮(Mediate N:10 g N m-2a-1)、高氮(High N:15 g N m-2a-1)。自2003年7月開始,以NH4NO3為氮源,每月月初以溶液的形式噴灑到樣地地面,全年平均噴施,并在整個研究期間持續進行。根據氮處理水平的需要,將每個樣方每次所需要噴施的NH4NO3溶解在20 L水中, 對照(CK)、低氮(LN)、中氮(MN)、高氮(HN)四個處理溶液的濃度分別為0、0.3、0.6和0.9 mol N/L。然后以背式噴霧器人工來回均勻噴灑在林地上,噴灑高度1.5 m左右(為了確保肥料的均勻分布,在每個地塊上都有兩條路徑)。對照樣方則噴灑等量的水。

1.2 土壤樣品的采集與處理

2015年10月在季風林中每個樣方內進行采樣(12個樣方)。每個樣方內利用“五點混合法”用土鉆(直徑4 cm)采集0—10 cm的土壤,然后4 ℃低溫保存運往實驗室。將用于測定土壤無機氮和可溶性有機碳(DOC)浸提以及Biolog實驗的土壤4 ℃保存,并于一周內完成測定;其余土樣風干并用于土壤理化性質的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1土壤理化性質的測定

1.3.2土壤微生物碳源利用測定分析

土壤微生物群落碳代謝多樣性采用Biolog方法進行[34]：在超凈工作臺中,稱取10 g鮮土置于無菌錐形瓶中,加入90 mL 85%滅菌NaCl溶液,封口后,振蕩30 min(250 r/min)。靜置10 min后取5mL上清液,將溶液稀釋1000倍。最后用8通道移液器將上述稀釋液加到Biolog-ECO微平板(Biolog, Hayward, USA)的每個孔中,每孔150 μL。將接種好的Biolog-ECO微平板于25 ℃條件下培養,分別于0、12、24、36、48、60、72、96、120、144、168 h在微孔板讀數儀(Biolog, Inc, USA)上讀取590nm波長下的吸光值。Biolog-Eco平板測定的每孔顏色平均變化率(average well color development,AWCD),用來表示微生物群落利用單一碳源的能力即微生物的整體代謝活性,計算公式如下[35]：

式中,C為有碳源的每個孔的光密度值,R為對照孔的光密度值,n為碳源的數目,Biolog-Eco板的C源數目為31[36]。

本研究采用培養72 h光密度值分析土壤微生物群落功能多樣性,計算公式如下[37]：

Shannon-Wiener多樣性指數

豐富度指數S=被利用碳源的總數目(C-R>0.2的孔數)

式中,Pi=(C-R)/∑(C-R)表示第i個孔的相對吸光值與整個微平板相對吸光值總和的比值。

圖1 不同濃度N處理下土壤微生物群落AWCD值隨培養時間的變化Fig.1 Changes of AWCD of soil microorganism under different nitrogen additions with induction timeCK: 對照;LN: 低氮處理; MN: 中氮處理; HN:高氮處理

1.4 數據統計分析

不同處理下土壤微生物功能多樣性指數和碳源利用強度的差異用LSD檢驗確定(SPSS22.0)。在Canoco for Windows 5.0軟件中,利用培養96 h的AWCD數據對不同N處理下土壤微生物碳源代謝多樣性進行主成分分析(PCA)。用非參數的多元方差分析(PERMANOVA)檢驗不同N水平處理下土壤微生物碳源代謝多樣性的差異。對季風林中環境因子和培養96 h的AWCD數據進行典型對應分析(CCA)和方差分解分析(VPA),探討環境因子對微生物碳源代謝多樣性的影響。其中CCA和VPA通過R語言“vegan”程序包進行。

2 結果

2.1 長期不同N量添加對土壤微生物碳源代謝活性影響

由圖1所知,隨著培養時間的延長,不同N水平處理下的平均吸光值(AWCD)值均呈現出逐漸增加的變化趨勢,并且曲線為平滑的“S”型曲線。0—24 h,土壤微生物的AWCD值緩慢變化;24—96 h AWCD值快速增長,隨后增長變緩慢,在96 h后趨于平緩。在整個培養過程中,季風林中AWCD值的大小順序為：CK>LN>MN ≈ HN。對整個培養過程做重復性方差分析發現：與CK相比,長期MN(P=0.024)和HN(P=0.015)處理顯著降低了土壤微生物碳源代謝活性(AWCD)。

2.2 長期不同N量添加對不同碳源利用強度以及多樣性影響

Biolog-Eco板中含有31種碳源,包括糖類(7種)、羧酸類(9種)、氨基酸類(6種)、胺類(2種)、聚合物類(4種)、酚酸類(3種)。不同N水平添加處理下土壤微生物群落對同一類型碳源的利用強度存在明顯差異。具體表現在：隨著N添加水平的提高,微生物對糖類、羧酸、氨基酸、胺類和酚酸類的利用率顯著降低;尤其是HN處理最為明顯,與CK(對照)相比分別降低了35.3%、48.9%、41.6%、80.2%和32.8%。不同N水平處理沒有影響聚合物類的利用。

為了進一步確定N添加對土壤微生物碳源利用率的影響,本文計算了Shannon多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數(表1)。與CK相比,長期MN和HN處理顯著降低了碳源豐富度指數以及Shannon多樣性指數。而均勻度指數結果表明,MN和HN顯著高于CK。

圖2 季風林中不同濃度N處理下土壤微生物碳源利用強度Fig.2 Utilization intensities of carbon sources under different nitrogen additions柱形上方不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)

林型Forest type處理TreatmentShannon多樣性指數Shannon-Wiener index豐富度指數Richness index均勻度指數Evenness季風林CK3.17±0.02a22±2.08a1.03±0.04bMonsoon forestLN 3.15±0.02a 19±0.88ac 1.06±0.01abMN3.02±0.12b16±1.17b1.10±0.02aHN3.03±0.06b 18±2.86bc1.09±0.02a

同列不同字母表示差異顯著(P< 0.05)

2.3 分析長期不同N量添加對土壤微生物碳源利用主成分分析

圖3 不同濃度N處理下土壤微生物群落對碳源利用多樣性的主成分分析Fig.3 Principal components analysis (PCA) of soil microbial carbon source utilization diversity under different nitrogen additions

利用培養96 h的AWCD數據,對31種碳源利用情況進行主成分分析(圖3)。主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的方差貢獻率分別為63.1%和15.1%,累計方差貢獻率為78.2%,說明PC1和PC2是微生物群落碳源利用變異的主要來源,可以解釋變異的大部分信息。統計檢驗表明不同N水平添加對土壤微生物群落在碳源利用上有明顯的分異(圖3,PERMANOVA檢驗,P=0.001)。

2.4 長期不同N量添加下土壤微生物碳源利用的主要環境影響因子

圖4 不同濃度N處理下土壤微生物群落碳源利用環境因子影響的分類變異分析Fig.4 Variation partitioning analysis (VPA) of carbon source utilization diversity and environmental factors under different nitrogen additions

為了更好的明確影響土壤微生物碳源利用的主要顯著影響環境因子,將與之相關的10個環境因子進行了典型對應分析(CCA)(圖5)。檢驗結果如下：引起不同N添加下土壤微生物碳源利用顯著差異最主要的土壤因子是土壤pH(F=4.78,P=0.009)。植被因子(植被豐富度和凋落物量)與土壤微生物碳源利用差異無顯著相關性。

圖5 不同濃度N處理下土壤微生物群落碳源利用多樣性與環境因子的典型對應分析Fig.5 Canonical correspondence analysis (CCA) of carbon source utilization and environmental factors under different nitrogen additions

3 討論

本研究發現不同N水平添加顯著影響了土壤微生物對不同碳源的利用能力以及碳源利用多樣性。一般來說,土壤微生物碳源利用率和AWCD值之間成正比例關系,即AWCD可反映土壤微生物活性對碳源利用能力或利用強度[24,38]。本研究中,季風林中土壤微生物碳源利用強度隨N添加量的增加而顯著降低,和Compton等[39]在Harvard森林長期氮輸入實驗結果一致。我們還發現糖類、羧酸、氨基酸、胺類和酚酸類碳源的利用隨著施N水平的提高顯著下降(圖2)。長期高劑量N添加顯著降低土壤微生物碳源利用率的原因可能在于：一方面,長期施用N肥,不僅會降低微生物生物量[40- 41],而且對土壤微生物活性產生一定的負面影響[42],進而影響土壤微生物對底物的利用率;同時季風林樣地為相對富N環境[32],土壤中N元素基本上可能已經達到了飽和的臨界值,如果繼續施N肥,也會對微生物對碳源利用率產生一定的抑制作用[43]。Deforest等[42]在北方硬葉闊葉林氮沉降樣地中的試驗以及劉蔚秋等[44]在南亞熱帶林內生境中微生物底物利用能力影響的研究中也得出了類似的結論。但是也有研究發現施用N肥會提高微生物碳源利用多樣性或者無影響,比如Grayston等[45]在英國高山草地中發現,N增加提高了土壤微生物的碳源利用效率。Zhou等[14]則在對位于中國西北部的古爾班通古特沙漠的研究表明,土壤微生物對底物的利用率與N增加并沒有明顯關系。這些研究的差異可能主要與研究區域、施氮時間、研究時期等有關。

多樣性指數從本質上來說,一方面可以反映土壤微生物群落功能多樣性,另一方面也是評價土壤微生物群落利用碳源程度的重要指標,該值和微生物群落的多樣性、碳源利用效率之間有著正相關關系[46]。不同的碳源利用多樣性指數又可真實的反映土壤微生物群落功能多樣性的不同側面。本研究表明施N對土壤微生物的功能活性產生了顯著的影響,主要體現在Shannon指數和豐富度指數均隨著N濃度的增加均表現出降低的趨勢(表2)。部分研究也發現LN處理在不同程度上增加了均勻度和Shannon指數,而HN處理下則出現降低[22,47]。土壤微生物對土壤生態系統環境的改變反映非常的敏感[48]。不同濃度N添加處理可以通過直接或間接影響土壤理化性質、物質轉換以及營養物質的有效性,使土壤微生物生存的微環境發生改變,進而導致土壤微生物結構及其功能多樣性發生變化。MN和HN處理下土壤微生物功能多樣性顯著低于對照處理可能是多種環境因子共同作用的結果,其中主要包括土壤因子和氣候因子的多重作用以及兩者之間的交互影響(圖4、5)。

土壤pH(P<0.01)對土壤微生物碳源代謝產生極其顯著的影響的主要原因可能是施N量的增加會直接導致土壤pH的下降,進而對土壤中微生物群落的群落結構和活性產生顯著影響。劉蔚秋等[44]通過對南亞熱帶林內生境中土壤微生物對模擬大氣氮沉降的響應研究,以及Smolander等[49]、Aerts等[50]和Wallander等[51]的研究表明,持續的N增加使土壤含N量處于過飽和狀態,由此引起的土壤酸化、板結和毒效應可能是微生物功能改變、活性降低的重要原因。其他研究中曾發現類似的研究現象[52-54]。植物因素對土壤微生物碳源利用效率變異的解釋程度較小,這可能與該樣地林齡較長而處于緩慢生長期等因素有關。

4 結論

長期不同N量添加顯著降低了土壤微生物碳源代謝活性,同時改變了土壤微生物對底物(不同碳源)的利用模式,進而引起微生物碳源利用多樣性發生相應的改變。土壤pH因子是長期不同N水平處理下微生物碳源利用變異的主要影響因素。該研究結果可為熱帶森林生態系統生物多樣性和生態系統功能改變對全球變化響應提供了理論依據和數據支撐;同時對于推動森林生態系統可持續發展和加強對其管理和功能調控也具有重要的科學意義。