中高溫大曲曲塊部位間生化指標的差異及變化規律

楊勇，李燕榮，姜雷，賈亞偉，王啟彪

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷，223800)

“曲是酒之骨”，大曲在濃香型白酒生產中起著至關重要的作用[1]。大曲作為一種富含多酶多菌的微生態制品，具有糖化、發酵、生香等功能，是傳統固態發酵蒸餾大曲酒的重要物質保障[2]，其品質好壞直接決定了酒的風格及檔次。作為塊狀曲，不同曲塊部位因通氣性、水分、溫度等微環境的差異而呈現不同的質量[3]。

本文選取中高溫大曲為研究對象，將塊狀曲細分為曲皮、曲心及火圈，研究曲塊部位間生化性能的差異，結合在培菌發酵過程中變化規律和相關性的研究，進一步剖析大曲的生化功能，為制曲工藝的調整、優化甚至現代化提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料與主要試劑

大曲樣品：中高溫大曲，選擇7月上旬入房發酵的四房曲進行跟蹤研究。

HCl，NaOH，H2SO4，可溶性淀粉，CuSO4，酒石酸鉀鈉，亞鐵氰化鉀，醋酸，醋酸鈉，三氯乙酸，乳酸鈉，Na2CO3，酪素，乙醇，己酸，正庚烷等均為分析純。

1.2 儀器與設備

分析天平、生化培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、控溫水浴鍋、干燥箱、分光光度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣

1.3.1.1 成品曲曲塊部位間取樣

將成品大曲拆分為曲皮、火圈與曲心，分3批次，每批次取3房，每房10塊曲粉碎混勻作為1個樣本，每個部位9個樣本，取平均值。

1.3.1.2 大曲發酵過程取樣

對發酵期全流程進行跟蹤并取樣。取樣時間分別為主發酵期(1、2、3 d)、潮火期(4、5、6、7 d)、大火期(8、9、10、11、13、15 d)、后火期(17、19 d)、養曲期(22、25、29、32、36 d)。采用五點取樣法，將曲樣分為曲皮樣和曲心樣，并依據軟硬情況，用粉碎機進行粉碎，過40目篩備用。

1.3.2 檢測方法[4]

水分測定：采用快速烘干法，130 ℃ 烘1 h；利用酸、堿中和法測定酸度，以10 g曲消耗0.1 mol/L的NaOH溶液的毫升數表示，單位mmol/10 g曲；淀粉測定采用1∶4的HCl進行加熱回流水解，用斐林試劑測定生成的糖；糖化力測定：采用斐林溶液滴定法測量，即1 g干曲在35 ℃、pH 4.6條件下反應1 h，將可溶性淀粉分解為葡萄糖的毫克數(U/g)；發酵力測定：1 g曲樣在25 ℃糖化液中發酵48 h失重的質量分數(g/10 g)；酯化力測定：0.8 g絕干曲在乙醇庚烷和己酸庚烷溶液中30 ℃條件下反應72 h，用NaOH滴定未消耗的己酸；酸性蛋白酶活力測定：1 g曲在一定的溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活單位，以U/g表示。

1.4 數據處理

結果采用平均值±標準偏差表示。數據采用SPSS 21.0軟件和Excel進行統計分析、繪圖和相關性分析，顯著性水平設定在5%。

2 結果與分析

2.1 中高溫成品大曲不同部位間生化指標的差異

由表1可知，大曲不同部位的理化、酶系及菌數都呈現顯著性差異。就理化特征而言，曲皮中的水分和酸度最小，其次是曲心，火圈最大；而淀粉在大曲不同部位中的含量差異則相反，曲皮略高于曲心。就酶活而言，曲皮的糖化力、發酵力最高，其次是火圈，曲心最低；酯化力則相反，曲皮最低，火圈次之，曲心最高；酸性蛋白酶活力則是曲皮遠大于火圈和曲心，曲心略高于火圈。就菌數而言，曲皮中的細菌、霉菌和酵母數量都遠高于其他部位，占絕對優勢，曲心中的細菌最低，火圈中的霉菌數量則是最低的。

表1 成品大曲曲塊部位間生化指標的差異Table 1 Difference of biochemical indexes between parts of finished daqu

不同字母表示同行具有顯著性差異。

2.2 中高溫大曲部位間生化指標在發酵期的變化規律

2.2.1 曲心溫度變化規律

通過跟蹤大曲在培菌發酵過程中的曲心溫度，取平均值，結果如圖1所示。大曲發酵整體表現為前緩中挺后緩落，第8天頂火，占火8 d左右，后緩慢落火至48 ℃，此后進入養曲期。就各階段而言：當前季節，大曲培菌發酵在第4天并房，并房溫度48 ℃，并房過程中溫度稍有降低；第7天上架，上架溫度56 ℃左右；第8天達到頂火溫度，頂火溫度最高可達到60 ℃以上；占火8 d后進入后火期，第20天落至48 ℃；而后進入養曲期，養曲15 d后出房入庫貯存。

圖1 培菌發酵期曲心溫度的變化Fig.1 Temperature variation of Daqu during fermentation

2.2.2 水分變化規律

微生物的生長離不開水分，水的比熱高，能夠吸收微生物生長代謝過程中釋放的熱量，具有調節大曲品溫的功能[5]。由圖2可知,入房時，大曲水分在38%左右；發酵前10 d，曲塊表面水分、氧氣都很充足，好氧性微生物霉菌和酵母大量繁殖，曲溫也逐漸上升，結合翻曲與放門排潮等工藝操作，曲皮水分迅速減少，在第10天即大火第3天后就基本散失殆盡，低至12%左右；曲心水分則在發酵初期變化不大，當曲塊溫度逐漸升高至大火期，曲皮水分散失嚴重，不能滿足微生物的繁殖所需，而此時曲心水分充足，曲心處“高濕”、“微氧”的環境極其有利于微生物的生長[6]，迫使微生物由曲皮轉向曲心內部生長繁殖，曲心水分借助大曲穿衣過程中霉菌菌絲滲透形成的微孔通道外排，發酵10 d后呈遞減趨勢，出房時達到13%左右。在整個培菌發酵過程中，曲心的水分始終高于曲皮，水分是由外到里逐漸散失。

圖2 大曲培養過程中不同部位的水分變化Fig.2 Variation of water content in different parts of Daqu during culture

2.2.3 酸度變化規律

大曲酸度主要由兩方面形成，一方面是由于生酸微生物代謝形成的有機酸，另一方面來源于微生物通過三羧酸循環降解蛋白質、脂肪和淀粉而形成的各種酸類物質[5]。由圖3可知，大曲的制曲前期因代謝旺盛，發酵第4天出現一個產酸高峰，曲心酸度高達2.3 mmol/10 g曲左右，曲皮酸度則升至1.3 mmol/10 g曲左右；酸度的大小與微生物數量變化有很密切的關系，尤其與芽孢桿菌數量變化成正相關[7]；放門排潮后，曲皮酸度降至與入房時相當，曲心酸度則維持高位平緩態勢；進入大火期后，不耐熱的微生物大量死亡，曲心酸度也迅速遞減，曲皮酸度則先略降后又略升；下柴后，部分耐高溫芽孢桿菌開始生長繁殖，曲皮與曲心酸度小幅上升，伴隨著曲皮與曲心水分散失殆盡，微生物無法生存，曲皮與曲心酸度又緩落直至發酵結束。

圖3 大曲培養過程中不同部位的酸度變化Fig.3 Variation of acidity in different parts of Daqu during culture

2.2.4 淀粉變化規律

大曲的淀粉為微生物的生長繁殖提供了營養和前體物質基礎，是大曲重要指標之一。制曲發酵過程中的淀粉含量(折算為12%水分條件下)變化情況如圖4所示。入房時，大曲淀粉含量為64%左右；發酵初期，微生物大量生長與繁殖，淀粉被快速消耗利用，曲皮與曲心淀粉含量均呈遞減趨勢；直至進入大火后，60 ℃左右的高溫使曲皮與曲心的微生物大量死亡，僅存能夠耐高溫的芽孢桿菌，因此，淀粉消耗很少而保持平緩趨勢直至發酵結束。整個發酵過程中，曲心淀粉含量始終略高于曲皮，這也與曲心微生物遠低于曲皮相對應。

圖4 大曲培養過程中不同部位的淀粉變化Fig.4 Variation of starch in different parts of Daqu during culture

2.2.5 糖化力變化規律

糖化力是糖化型淀粉酶將淀粉糖化生成葡萄糖的過程[5]。其活力的高低直接關系到釀酒過程中淀粉的轉化率。由圖5可知，入房時，大曲糖化力高達760 mg葡萄糖/(g曲·h)，這主要是因為大曲是生料發酵，原料中小麥自身就含有一定的糖化酶；但原料自身糖化力易受溫度影響，極不穩定；主發酵期，曲溫逐步上升，與糖化力相關的好氧性微生物霉菌在曲皮大量繁殖，原料自身攜帶的糖化力雖快速降低，但霉菌代謝生成的糖化酶則快速增長，導致曲皮的整體糖化力基本無變化，但曲心中霉菌很少，糖化力在入房2 d后即快速下降至30 mg葡萄糖/(g曲·h)左右；放門排潮后，曲溫進一步上升，曲皮水分進一步降低，霉菌代謝受到抑制，細菌開始占據主導優勢，糖化力快速下降直至入房時的一半，曲心糖化力維持低位；進入大火與后火期，微生物大量死亡，曲皮糖化力先緩升后緩降，變化幅度不大，曲心糖化力仍無變化；養曲期，隨著曲溫逐漸降到室溫，曲心部分尚有余水，少數耐干燥的紅曲霉菌等微生物尚能發育，曲皮糖化力開始回升并呈波動式變化，曲心糖化力也緩慢升高；出房時，曲皮糖化力為600 mg葡萄糖/g(曲·h)左右，曲心約為150 mg葡萄糖/(g曲·h)。就整個培菌發酵過程而言，結合成品曲不同部位的糖化力，不難發現大曲糖化力主要來自于曲皮。

圖5 大曲培養過程中不同部位的糖化力變化Fig.5 Variation of saccharifying power in different parts of Daqu during culture

2.2.6 發酵力變化規律

發酵力是大曲中的酶發酵糖產生CO2和生成酒精的過程強弱的評價，其變化主要是與酵母菌關系密切[5]。由圖6可知,在整個發酵過程中，曲皮與曲心發酵力的變化趨勢基本相同。發酵初始，大曲即具有高達12 g CO2/(10 g曲·48 h)的發酵力，這與釀酒區域存在大量野生酵母息息相關；發酵初期，曲塊溫度適宜，水分、氧氣充足，好氧微生物酵母大量增殖，在曲心中占絕對優勢，曲皮中也大量繁殖，發酵力快速上升至最高峰，即22 g CO2/(10 g曲·48 h)左右；放門排潮后，隨著曲塊溫度的進一步升高和水分的流失，酵母增殖受阻，因此發酵力快速下降；之后的環境條件更加苛刻，營養物質的轉移和補充也較困難，酵母已處于難以生長的境地，死亡速度與繁殖速度相比時高時低，曲皮與曲心的發酵力呈波浪式緩升緩降，變化不大；發酵15 d后，曲塊落火，曲皮較曲心溫度低，導致酵母在曲皮中的數量高于曲心，發酵力也略高于曲心，這也與成品曲中曲皮酵母數量和發酵力顯著高于曲心一致。

圖6 大曲培養過程中不同部位的發酵力變化Fig.6 Variation of fermenting power in different parts of Daqu during culture

2.2.7 酯化力變化規律

酯化力是大曲自身經發酵后固有的催化生酯的能力。由圖7可知，在培菌發酵過程中，曲皮與曲心的變化趨勢基本相同，前期波動幅度較大，而后呈緩升緩降后平穩的趨勢；發酵初期，微生物在低溫高水分的條件下極易生長，入房后各類微生物便開始發育，在曲柸上大量生長繁殖，此時主要進行數量增殖；在潮火中后期，各類微生物數量達到極限，開始啟動代謝酯化酶，酯化力快速上升，發酵第8天達到峰值；此時，曲塊已達到頂火溫度，不耐熱微生物大量死亡，霉菌和酵母的代謝受到抑制，酯化酶活力迅速降至谷底，發酵第10天后保持平緩；落火后，由于曲皮部分含水低，微生物很難生長，但曲心部分含水稍高，少數耐干燥的紅曲霉菌等微生物尚能發育，代謝生成酯化酶，曲心酯化力有所回升；養曲期間，曲心水分進一步散失，微生物生存條件更加惡劣，酯化酶活力緩慢下降，出房時酯化力在10%左右。

圖7 大曲培養過程中不同部位的酯化力變化Fig.7 Variation of esterifying power in different parts of Daqu during culture

2.2.8 酸性蛋白酶活力變化規律

酸性蛋白酶能在低pH條件下有效水解蛋白質，在白酒發酵過程中起協同作用，溶解發酵原料的顆粒，促進微生物繁殖，分解蛋白質生成香味物質，分解酵母菌體蛋白，但活力過高卻會阻礙生料發酵，使酒焦苦味重。由圖8可知，在培菌發酵過程中，曲皮與曲心的酸性蛋白酶活力變化趨勢基本相同，潮火期開始迅速增長，大火期開始迅速下降，后期呈平緩趨勢；發酵初期，各種微生物可以吸收原料中自帶的氨基酸進行生長繁殖；進入潮火期后，隨著微生物的進一步生長繁殖和原料自帶氨基酸的消耗，微生物靠自身代謝產生蛋白酶分解產生大量氨基酸來滿足微生物的增殖需求；隨著大曲進入高溫發酵期，微生物數量銳減，氨基酸也參與美拉德反應生成曲香風味物質，加上蛋白酶耐熱性較差，酸性蛋白酶活力迅速下降；后期隨著大曲水分的進一步散失，微生物生長環境進一步惡化，蛋白酶活力基本呈平緩趨勢。

圖8 大曲培養過程中不同部位的酸性蛋白酶活力變化Fig.8 Variation of acid protease activity in different parts of Daqu during culture

2.2.9 微生物區系變化規律

大曲的生產是開放式的，微生物來源十分廣泛，包括原料、環境、工具、操作等，群落十分復雜。根據微生物的形態和生理特性，主要包括細菌、霉菌與酵母菌[8]。由圖9可知，入房時以細菌為主導，由外源帶入；主發酵期，酵母大量增殖，在曲心中占絕對優勢，曲皮中也大量繁殖，霉菌在主發酵后期開始大量增殖；潮火期，隨著溫度的進一步上升，曲心中細菌開始占優勢，主要是產酸細菌，曲皮則是由細菌和霉菌共同主導，因此，潮火期是霉菌大量繁殖的重要時期；進入大火期后，曲皮與曲心都是細菌占絕對優勢，以耐熱的芽孢桿菌為主，曲皮中仍有少量霉菌以孢子形式存在；落火及養曲期間，經過高溫馴化，曲皮與曲心中仍然是細菌占絕對優勢，霉菌與酵母很少。

圖9 大曲培養過程中曲皮與曲心微生物數量占比Fig.9 Variation of microbial number proportion between curved skin and inside of Daqu

2.3 相關性分析

大曲發酵過程中，生化指標之間具有一定的相關性，且曲皮與曲心之間也有一定的差異性。如表2所示,糖化力與淀粉、細菌數量以及曲皮的水分和曲心的酵母之間都呈顯著正相關，發酵力與水分、淀粉、酵母以及曲皮細菌數量顯著正相關，發酵力、曲皮糖化力都與曲心溫度呈顯著負相關，說明隨著淀粉的消耗、曲皮水分的散失和曲心溫度的升高，糖化力和發酵力總體呈下降趨勢，進而影響細菌和酵母數量的增殖，同時說明發酵力主要由酵母提供，與傳統理論一致；酯化力、酸性蛋白酶活力則與水分和淀粉之間相關性不大，說明其還與其他因素相關，如溫度、酸度等，表2顯示曲皮和曲心的酸性蛋白酶都與曲心溫度呈顯著正相關，曲心中的酸性蛋白酶還與酸度呈顯著正相關，曲皮中的酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關，說明曲心溫度的升高和產酸微生物的生長代謝可以促進酸性蛋白酶的代謝生成，代謝生成的有機酸也為酯化反應提供前體物質。

表2 大曲在發酵過程中生化指標之間的相關性Table 2 The correlation between biochemical indexes of Daqu during fermentation

**.在0.01水平(雙側)上顯著相關;*.在 0.05水平(雙側)上顯著相關。

3 結論與展望

本文通過將中高溫大曲拆分為曲皮與曲心，研究生化性能的差異及其在培菌發酵期間的變化趨勢，發現中高溫大曲部位間生化性能在成品曲和培菌發酵過程中都具有一定的規律性，且相互之間具有一定的相關性。主要結論如下：

(1)從結構上細分了中高溫成品大曲的生化性能。曲皮的菌系最豐富，各類微生物均占優勢，酶活也最高，但酯化力最低；曲心的細菌數量最低，糖化力與發酵力最低，酯化力最高；火圈的酵母和霉菌最少，以細菌為主，水分、酸度最大，酸性蛋白酶活力最低，其他性能居中。

(2)明晰中高溫大曲不同部位的生化性能在培菌發酵過程的變化規律。主發酵期，酵母大量增殖，發酵力速升，曲心糖化力速降、酸度快速增加，曲皮水分快速散失；潮火期，發酵力速降，酯化力和酸性蛋白酶活力上升，酸度平緩，曲皮中的霉菌先升至峰值后回落、水分進一步降低；大火期，酶活和微生物數量都低，曲心的水分和酸度開始降低；落火后，酯化力、酸性蛋白酶活力和曲心糖化力有所回升；養曲期，糖化力繼續上升，酯化力與酸性蛋白酶活力緩降，曲心水分進一步散失。

(3)研究發現中高溫大曲的糖化力主要來自于曲皮，發酵力主要形成于主發酵階段，酵母增殖也主要在主發酵階段，霉菌增殖主要在潮火階段，酯化力和酸性蛋白酶活力在大火初期達到峰值。

(4)相關性分析結果表明，糖化力與淀粉、細菌數量以及曲皮的水分和曲心的酵母之間都呈顯著正相關，發酵力與水分、淀粉、酵母以及曲皮細菌數量顯著正相關，發酵力、曲皮糖化力與曲心溫度呈顯著負相關，曲皮和曲心的酸性蛋白酶與曲心溫度呈顯著正相關，曲心中的酸性蛋白酶與酸度呈顯著正相關，曲皮中的酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關。

為了全面了解中高溫大曲微生物群落及其多酶體系演變的內在機理，還需要結合現代分子生物學方法和大曲功能微生物的分離鑒定與代謝分析，從而明晰中高溫大曲生化功能形成的內在推動力，為制曲工藝優化和制曲方法現代化提供理論借鑒。