超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定奶粉中N-乙酰神經(jīng)氨酸

任艷嬌，劉玉淑，伍姚，喻卉，李偉麗，吳韜

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039)

唾液酸(sialic acid，SA)是指一系列含9個(gè)碳原子的羧基化單糖酰化衍生物的統(tǒng)稱(chēng)，目前為止已發(fā)現(xiàn)其有40多種衍生物[1-3]。唾液酸結(jié)構(gòu)特征在于5號(hào)碳上的氨基以及 1號(hào)碳上的羧基給唾液酸分子授予了1個(gè)負(fù)電荷使得唾液酸表現(xiàn)為酸性，其主要存在形式為氨基被乙酰化的N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid(Neu5AC)，多用于修飾神經(jīng)細(xì)胞黏附分子。它對(duì)生物神經(jīng)細(xì)胞連接、調(diào)節(jié)細(xì)胞聚合以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)起著重要的作用[4-5]，同時(shí)Neu5AC還參與了人體內(nèi)特異性生物功能的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞識(shí)別，細(xì)胞黏附，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和免疫功能調(diào)節(jié)等。它在抑制唾液酸轉(zhuǎn)移酶和抗癌轉(zhuǎn)移、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增長(zhǎng)與抗老年癡呆癥、抑制唾液酸酶與抗病毒、抑制白細(xì)胞黏附與抗炎等方面具有很大作用[6]。因此近年來(lái)，關(guān)于Neu5AC的研究受到極大的關(guān)注[7-12]。

常用的測(cè)定糖類(lèi)的方法包括分光光度法、氣相色譜(GC)法和高效液相色譜(HPLC)法。分光光度法的主要缺點(diǎn)是選擇性差，難以區(qū)分與唾液酸相似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)干擾[13]。GC是一種較靈敏的分析方法，但樣本需要衍生化，耗時(shí)費(fèi)力[14]。HPLC方法也廣泛用于分離確定唾液酸[15]，但唾液酸屬于糖類(lèi)化合物且沒(méi)有發(fā)色基團(tuán)，所以采用HPLC分析需要對(duì)唾液酸進(jìn)行衍生后測(cè)定，因而增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和可能的干擾因素[16]。已有研究報(bào)道采用超高效液相色譜—串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS-MS)測(cè)定唾液酸[17]，但是串聯(lián)四級(jí)桿檢測(cè)器存在碎片離子分辨率低、定性能力弱等缺點(diǎn)。串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS)是一種高分辨質(zhì)譜，通過(guò)UHPLC超高的分離能力結(jié)合QTOF-MS高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)，利用保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)碎片的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)、離子豐度和標(biāo)準(zhǔn)品等能同時(shí)對(duì)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性、定量分析[18-19]。

母乳中尤其是初乳唾液酸水平和嬰兒早期智能發(fā)育密切相關(guān)，提高唾液酸攝人量有益于嬰兒早期發(fā)育。國(guó)內(nèi)外配方奶粉已將Neu5AC作為奶粉營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的一個(gè)重要參數(shù)，使其更接近母乳的自然標(biāo)準(zhǔn)。因此，需要尋找一種簡(jiǎn)單、可靠方法來(lái)測(cè)定母乳中Neu5AC含量，為配方奶粉的生產(chǎn)提供參考。目前國(guó)內(nèi)外，還未見(jiàn)應(yīng)用UHPLC-QTOF-MS方法測(cè)定奶粉中Neu5AC的相關(guān)報(bào)道。本文采用UHPLC-QTOF-MS對(duì)奶粉中Neu5AC進(jìn)行測(cè)定，為配方奶粉工藝優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)提升等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉樣品，本地超市；三氯乙酸(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)品(純度：99.49%)，Sigma公司；乙腈(色譜純級(jí))，Sigma公司；乙酸銨(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司；X500飛行時(shí)間質(zhì)譜，美國(guó)SCIEX公司；BT-25S分析天平，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；SB-5200DTN超聲清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；VORYEX 3渦旋混勻器，德國(guó)IKA公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Neu5AC儲(chǔ)備液的制備

精確稱(chēng)量Neu5AC標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，用V(甲醇)∶V(水)=1∶1配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備液，于-20 ℃下儲(chǔ)備備用。

1.3.2 Neu5AC工作液的制備

準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇逐級(jí)稀釋為質(zhì)量濃度50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μg/mL系列Neu5AC標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品制備

精確稱(chēng)取2.0 g奶粉樣品于15 mL離心管中，加入5 mL 5%三氯乙酸溶液，旋渦振蕩，超聲波處理5 min，加入體積分?jǐn)?shù)0.1%鹽酸溶液5 mL，旋渦混勻轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中 80 ℃水浴加熱水解2 h，水解完成后冰浴冷卻到室溫，15 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于1.5 mL離心管中，于真空旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入1 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.3.4 色譜分析條件

色譜柱：采用C18色譜柱(1.9 μm粒徑，2.1 mm×100 mm)；色譜柱溫度：40 ℃；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.01%乙酸銨-水溶液；進(jìn)樣量：5 μL，流速0.25 mL/min，梯度洗脫程序如下：0～2 min，20%A；2～4 min，50%A；4～5 min，50%A； 5～6 min，20%A。

1.3.5 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，負(fù)離子模式；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；氣簾氣(curtain gas，CUR)35 psi，離子化壓力(ionization pressure，IS)4 500 V，溫度300 ℃，噴霧氣(spray gas，GS1)45 psi，輔助加熱氣(auxiliary heating gas，GS2)55 psi，去簇電壓(de-clustered voltage，DP)60 V，碰撞能量(collision energy，CE)10 V，質(zhì)量掃描范圍m/z100～500。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

繪圖以及統(tǒng)計(jì)分析均采用Origin 9.6軟件進(jìn)行處理分析。

1.3.7 方法學(xué)驗(yàn)證

檢出限、定量限和精密度的測(cè)定：將質(zhì)量濃度為1.56 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)?jì)算檢出限(S/N=3)與定量限(S/N=10)[20]。

回收率的測(cè)定：在已知Neu5AC含量的老年奶粉樣品中分別添加低(0.5 μg/mL)、中(5 μg/mL)、高(50 μg/mL)3個(gè)濃度Neu5AC標(biāo)品溶液，放置2 h，按照已優(yōu)化的樣品處理方法進(jìn)行前處理[21]，加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次。

基質(zhì)效應(yīng)：采用樣品提取溶液直接溶解Neu5AC標(biāo)準(zhǔn)品，然后用樣品提取溶液對(duì)其進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋?zhuān)M(jìn)樣檢測(cè)，得到基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，以相同物質(zhì)在基質(zhì)溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)曲線斜率來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Neu5AC的裂解機(jī)制及定性、定量離子對(duì)選擇

以往對(duì)Neu5AC在Q-TOF中的裂解機(jī)制研究尚不完善，所以本實(shí)驗(yàn)選擇Neu5AC標(biāo)準(zhǔn)溶液(25 μg/mL)分別在ESI-和ESI+條件下對(duì)母離子進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明Neu5AC在ESI-條件下其母離子豐度高于ESI+，與前人研究一致[22]。表1為Neu5AC母離子及其定性、定量離子高分辨質(zhì)譜信息，由表1得，采用Q-TOF方法檢測(cè)Neu5AC時(shí)，其理論值與實(shí)驗(yàn)值誤差較小，表明該方法對(duì)Neu5AC定性精確度較高。由圖1可知，Neu5AC在進(jìn)入質(zhì)譜過(guò)后，由于失去1個(gè)水分子得到m/z290的分子，m/z290可能發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(retro-Diels-Alder reaction，RDA)，裂解成為m/z170和m/z119 兩個(gè)分子，另外，Neu5AC在質(zhì)譜分析中，還可能發(fā)生α斷裂，經(jīng)過(guò)電荷轉(zhuǎn)移，發(fā)生重排，形成m/z220和m/z87 兩個(gè)互補(bǔ)離子。其中，m/z87的碎片離子在質(zhì)譜中響應(yīng)最高，m/z170次之，所以選擇m/z87的離子作為Neu5AC的定量離子，m/z170作為輔助定性離子。

表1 Neu5AC母離子與定性、定量離子質(zhì)譜信息Table 1 Neu5AC parent ion and qualitative and quantitative ion mass spectrometry information

圖1 奶粉中Neu5AC的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解機(jī)制Fig.1 Neu5AC secondary mass spectrum in the sample

2.2 提取溶劑的選擇

研究表明，在80 ℃條件下用0.1%(體積分?jǐn)?shù))HCl溶液水解1 h能夠使所有的唾液酸鏈斷裂并使這些殘基脫酰、脫羧化、能保證唾液酸的完全水解[23]。此外，樣品在不同比例溶劑中其定量峰面積存在差異[24]。因而，本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.56 μg/mL)為研究對(duì)象，考察不同濃度甲醇-水溶液作為溶劑時(shí)，對(duì)Neu5AC定量離子峰面積的影響，確定最佳的溶劑。圖2為不同比例甲醇作為復(fù)溶溶劑時(shí)對(duì)定量離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響。

圖2 不同甲醇濃度對(duì)定量離子峰面積影響Fig.2 Effect of different methanol concentration on quantitative ion peak area

由圖2可知，隨著甲醇比例的增加，峰面積呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇作為溶劑時(shí)，Neu5AC的定量峰離子峰面積最高，因此選擇50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇-水溶液作為樣品復(fù)溶時(shí)最佳溶劑。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系考察

將質(zhì)量濃度為1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照優(yōu)化的液相、質(zhì)譜條件上機(jī)進(jìn)行分析，得到Neu5AC的線性回歸方程為y=12 078.257x-14 476.865，R2=0.999。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在1.56～50 μg/mL，Neu5AC線性良好。

2.3.2 回收率、重復(fù)性、檢出限與定量限

由表2可知，本方法的平均回收率在86.79%～93.64%，平均回收率的RSD在3.78%～6.42%，表明用該方法測(cè)定Neu5AC準(zhǔn)確可行，分析得到Neu5AC的定量限為0.30 μg/mL，檢出限為0.05 μg/mL，表明該方法具有較好的重復(fù)性和較高的靈敏度。

表2 回收率、重復(fù)性檢出限及定量限(n=6)Table 2 Recovery rate, repeatability detection limit and limit of quantitation

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中目標(biāo)物以外的組分，與目標(biāo)物共同洗脫出的樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的離子化過(guò)程產(chǎn)生影響[25]。根據(jù)研究表明[26-27]，當(dāng)|基質(zhì)效應(yīng)|<20%,可認(rèn)為基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)值影響很小，可認(rèn)為無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)20%≤|基質(zhì)效應(yīng)|<50%,被認(rèn)為具有中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|基質(zhì)效應(yīng)|≥50%，被認(rèn)為具有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。由表3可知，Neu5AC的基質(zhì)效應(yīng)為-14.14%，說(shuō)明奶粉基質(zhì)對(duì)Neu5AC的離子化具有抑制作用，又因?yàn)閨基質(zhì)效應(yīng)|<20%，說(shuō)明奶粉基質(zhì)對(duì)Neu5AC的定量分析影響較小，可忽略不計(jì)。

表3 基質(zhì)效應(yīng)與校準(zhǔn)曲線Table 3 Matrix effect and calibration curve

2.4 樣品測(cè)定

應(yīng)用建立的分析方法對(duì)4種奶粉中Neu5AC進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。由表4可得，在4種奶粉中均檢測(cè)出Neu5AC，但是含量差異顯著，其中老年奶粉中含量最高，為3.14 mg/100 g，低脂奶粉中含量最低為2.02 mg/100 g。

表4 樣品中Neu5AC含量 單位：mg/100 g

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定奶粉中Neu5AC含量的檢測(cè)方法，避免了復(fù)雜的衍生化過(guò)程。通過(guò)分析Neu5AC的二級(jí)質(zhì)譜信息，為Neu5AC的定性、定量提供了依據(jù)。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，Neu5AC的加標(biāo)回收率在82.83%～88.42%，檢出限和定量限分別為0.05 μg/g和0.30 μg/g，基質(zhì)效應(yīng)為-14.14%，在1.56～50 μg/mL，Neu5AC線性良好，表明本研究建立的方法具有較好的準(zhǔn)確性，可廣泛應(yīng)用于奶粉及其他奶制品Neu5AC的定性、定量分析。