米曲霉種曲和堿性蛋白酶協(xié)同水解玉米-大豆蛋白復(fù)配物及其產(chǎn)物的抗氧化活性

馬瑞，劉祥，林巍，王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭*

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶，163319)3(黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是機(jī)體內(nèi)正常代謝產(chǎn)物，如超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥基自由基和氧原子等均為人體細(xì)胞內(nèi)ROS[1-4]，在參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡中起著重要作用。當(dāng)機(jī)體受到某些外界刺激時(shí)，活性氧的產(chǎn)生和清除失去平衡，使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而活性氧攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞衰老并誘發(fā)一系列疾病，如心血管疾病、糖尿病、癌癥、動(dòng)脈硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)退行性疾病[5-7]。具有抗氧化活性的物質(zhì)可以清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量自由基，對(duì)氧化應(yīng)激的細(xì)胞起到保護(hù)作用[8]。近年來(lái)，具有抗氧化活性的天然活性肽受到較多關(guān)注，如從玉米[9-13]、雞蛋[14]、大豆[15-17]中通過(guò)蛋白酶酶解制備的抗氧化活性肽，這些活性肽較人工合成的抗氧化劑更安全可靠，不僅可以提供人體所需的營(yíng)養(yǎng)還可調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài)。

玉米蛋白粉是濕法生產(chǎn)淀粉的主要蛋白副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量約為60%，富含亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸，缺乏色氨酸和賴氨酸等人體必需氨基酸；大豆蛋白的蛋白質(zhì)含量在90%以上，富含人體必需氨基酸色氨酸和賴氨酸。將玉米蛋白和大豆蛋白按一定比例復(fù)配后，復(fù)配物的氨基酸組成更加符合人體氨基酸需求。利用蛋白酶水解蛋白提高其功能性存在一個(gè)普遍問(wèn)題：隨著蛋白酶解反應(yīng)進(jìn)行，一些疏水性氨基酸基團(tuán)暴露在肽鏈的一端，蛋白水解物呈現(xiàn)一定苦味。米曲霉種曲在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生復(fù)合蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等，在食品發(fā)酵工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，用含多種蛋白酶的米曲霉種曲水解蛋白質(zhì)會(huì)降低水解物的苦味，在提高總體反應(yīng)轉(zhuǎn)化率、使反應(yīng)產(chǎn)物的生理功能性得到更多釋放與提高的同時(shí)，使蛋白水解物的苦味值保持在可接受范圍內(nèi)。

本研究用米曲霉種曲和堿性蛋白酶(alcalase)協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物，分析蛋白水解物的抗氧化活性，將蛋白水解物作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞)，研究其在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性和氧化應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉,黑龍江省龍鳳玉米開(kāi)發(fā)有限公司；Caco-2細(xì)胞,南京凱基生物技術(shù)有限公司；米曲霉種曲,黑龍釀造有限公司；堿性蛋白酶(alcalase),丹麥諾維信公司；DMEM (高糖) 培養(yǎng)基和胰蛋白酶,美國(guó)Gibico公司；胎牛血清(FBS),德國(guó)PAN公司；噻唑蘭(MTT),上海生工生物技術(shù)有限公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA),美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO) 和高效RIPA裂解液,北京索萊寶科技有限公司；活性氧(ROS)試劑盒,南京建成生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要的儀器與設(shè)備

NV4750E二氧化碳培養(yǎng)箱,NUAIRE(美國(guó))公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),安泰空氣技術(shù)(蘇州)有限公司；LX73熒光倒置顯微鏡,Olympus(日本東京)公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀,珀金埃爾默(美國(guó))公司產(chǎn)品；SX-500高溫蒸汽滅菌鍋,TOMY(日本)公司產(chǎn)品；PC/PLC-LD-53冷凍干燥機(jī),MILLROCK(美國(guó))公司；96孔板、6孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和移液管,Corning(美國(guó))公司。

1.3 研究方法

1.3.1 米曲霉種曲和alcalase協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物

將m(玉米蛋白)∶m(大豆蛋白)=7∶3的比例進(jìn)行混合，配成質(zhì)量濃度為100 g/L的蛋白懸液，用米曲霉種曲和alcalase協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物。米曲霉種曲的最適水解條件：55 ℃， pH 8.5，水解時(shí)間為22 h；alcalase的最適水解條件：60 ℃，pH 8.5，水解時(shí)間為2 h。在反應(yīng)過(guò)程中用1 mol/L NaOH維持pH穩(wěn)定，并記錄NaOH消耗量，計(jì)算水解過(guò)程中的水解度。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于沸水浴中滅酶15 min，冷卻后4 000 r/min離心15 min，測(cè)定上清液的Fe2+螯合能力和DPPH自由基清除率，剩余上清液凍干備用。

1.3.2 蛋白水解物的抗氧化活性測(cè)定

1.3.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

在10 mL離心管中加入2 mL CSPH溶液和2 mL 0.1 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液，振蕩搖勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，立即倒入石英比色皿中，在517 nm波長(zhǎng)下用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得吸光值，重復(fù)測(cè)定3次。按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.2.2 金屬離子(Fe2+)螯合能力的測(cè)定

在10 mL離心管中加入1 mL CSPH溶液、2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 0.5 mmo/L菲咯嗪溶液，振蕩搖勻后室溫下靜置10 min，立即倒入石英比色皿中，在562 nm波長(zhǎng)下用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得吸光值，重復(fù)測(cè)定3次。按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中，用DMEM (高糖)培養(yǎng)基，并向DMEM中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS)和體積分?jǐn)?shù)1%的雙抗作為Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用20～30代細(xì)胞。

1.3.4 蛋白水解物對(duì)細(xì)胞存活率的測(cè)定

將對(duì)數(shù)期Caco-2細(xì)胞以濃度為1×105cells/mL接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h，然后，每孔加入100 μL終濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL CSPH4培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，在37 ℃ 500 r/min微孔板振蕩儀振蕩10 min，在570 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率：

(3)

1.3.5 氧化應(yīng)激模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組

將Caco-2細(xì)胞以1×105cells/mL接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(0 mmol/L H2O2)；氧化應(yīng)激組(1 mmol/L H2O2)；實(shí)驗(yàn)組(0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/mL CSPH4+1 mmol/L H2O2)，細(xì)胞存活率測(cè)定方法同1.3.4。

1.3.6 蛋白水解物對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力測(cè)定

將Caco-2細(xì)胞以1×105cells/mL接種至96孔板，加CSPH4培養(yǎng)細(xì)胞2 h后，用1 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，PBS清洗細(xì)胞2次后，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，在CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，細(xì)胞用PBS清洗后，在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500 nm的條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。

(4)

1.3.7 蛋白水解物對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的測(cè)定

CAA(cellular antioxidant activity)測(cè)定參考WOLF和LIU的方法[18]，將Caco-2細(xì)胞以1×105cells/mL接種于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞1次，實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同濃度CSPH4的DMEM培養(yǎng)液，其中含25 μmol/L DCFH-DA的DMEM，作用Caco-2細(xì)胞2 h后，用100 μL PBS清洗細(xì)胞一遍，每孔加入100 μL 600 μmol/L的AAPH溶液，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm條件下，每5 min檢測(cè)一次,連續(xù)測(cè)定1 h。設(shè)定空白組和對(duì)照組，空白組僅采用DCFH-DA處理，但不加入AAPH；對(duì)照組采用DCFH-DA和AAPH自由基處理，但不加入樣品。實(shí)驗(yàn)中用Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。

(5)

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用SPSS Statistics 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用單因素方差分析(LSD檢驗(yàn))，P<0.05為差異性顯著水平。用GraphPad Prism 5繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米大豆蛋白復(fù)配物的水解

蛋白質(zhì)被蛋白酶水解時(shí)，不同的蛋白酶均有其特定的酶切位點(diǎn)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)不斷減少。用alcalase和米曲霉種曲協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物，可以很好地增強(qiáng)蛋白質(zhì)水解效果，將原料充分利用起來(lái)，提高利用率。

在玉米大豆蛋白復(fù)配物質(zhì)量濃度為100 g/L的條件下，考察了alcalase和米曲霉種曲在不同加酶順序和不同加酶量的條件下，協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物的效果，水解物的DH、可溶性蛋白含量、DPPH·清除率和亞鐵離子螯合能力的結(jié)果如表1所示。

表1 酶底比與加酶順序?qū)A性蛋白酶和米曲霉種曲協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物的影響Table 1 Hydroltsis effect of E∶S ratio and proteases adding sequence on corn soybean protein mixture by alcalase and Aspergillus oryzae

從表1可以看出，alcalase和米曲霉種曲的加入順序?qū)λ馕顳H和可溶性蛋白含量影響較大。在雙酶協(xié)同順序水解過(guò)程中，從DH和可溶性蛋白含量上來(lái)看，先用米曲霉的水解效果比先用alcalase的好。將米曲霉種曲的加酶量固定為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，改變alcalase的加酶量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)alcalase為0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，無(wú)論其為第1種酶或第2種酶，DH和可溶性蛋白含量均大于加酶量為0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))組；米曲霉+alcalase組合的水解效果要優(yōu)于alcalase和米曲霉組合，其可能原因是，米曲霉種曲蛋白酶系復(fù)雜，且活力不高，先加入米曲霉可以將破壞大分子蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)破壞，使alcalase的切割位點(diǎn)大量暴露出來(lái)，增加了alcalase的水解效率；而先加入alcalase，其自身就可以將大分子蛋白質(zhì)水解成大量分子量小于1 000 Da的肽段[19]，再加入米曲霉后，反應(yīng)體系中以小分子肽段為主，米曲霉自主產(chǎn)生的蛋白酶活力不高，導(dǎo)致這些蛋白酶沒(méi)有作用位點(diǎn)，水解效果沒(méi)有alcalase和米曲霉種曲組合好。雙酶協(xié)同水解復(fù)配物產(chǎn)物的抗氧化活性與DH和可溶性蛋白含量沒(méi)有正比關(guān)系，DH和可溶性蛋白含量高的時(shí)候，抗氧化活性不一定強(qiáng)。綜合實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的原料利用率情況和蛋白酶成本，將CSPH4作為接下來(lái)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的原料，此條件下DH、可溶性蛋白含量、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力分別為46.10%、(73.04±1.68) mg/mL、(41.26±0.69)%和(50.23±3.15)%。

2.2 CSPH4對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的CSPH4對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率存在顯著性(P<0.05)差異，與對(duì)照組相比，CSPH4在0.05～2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均≥對(duì)照組細(xì)胞存活率，即CSPH4對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)毒性。

圖1 玉米大豆蛋白水解物對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of corn soybean protein hydrolysate on Caco-2 cell viability注：肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05);相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

2.3 CSPH4對(duì)氧化應(yīng)激的Caco-2細(xì)胞的保護(hù)作用

不同濃度的CSPH4培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞后用1 mmol/L H2O2進(jìn)行氧化應(yīng)激，測(cè)得細(xì)胞存活率如圖2所示。

圖2 玉米大豆蛋白水解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激Caco-2細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.2 Cytoprotective effects of mixture of corn soybean protein hydrolysate on H2O2 induced oxidized Caco-2 cells

細(xì)胞經(jīng)1 mmol/L H2O2作用后，細(xì)胞存活率顯著(P<0.05)降低，表明氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。CSPH4在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，預(yù)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞后再進(jìn)行氧化應(yīng)激，與氧化應(yīng)激組相比，細(xì)胞存活率均顯著(P<0.05)提高，其中CSPH4濃度在0.05 mg/mL時(shí)保護(hù)細(xì)胞效果最好，此時(shí)細(xì)胞存活率可達(dá)到 92.82%，與H2O2氧化損傷組相比，細(xì)胞存活率提高了40%左右。WANG等[20]發(fā)現(xiàn)2種玉米肽組分濃度在0.05～2.5 mg/mL范圍內(nèi)可以顯著提高氧化應(yīng)激條件下HepG2細(xì)胞的存活率，對(duì)已發(fā)生氧化損傷的HepG2細(xì)胞有保護(hù)作用，濃度為2.5 mg/mL時(shí)，相比氧化損傷組細(xì)胞存活率來(lái)看，經(jīng)玉米肽預(yù)處理2 h后可使細(xì)胞存活率提高50%左右。YI等[21]研究了一種來(lái)源于雞蛋卵鐵蛋白的ACE抑制肽(Ile-Arg-Trp)對(duì)Caco-2細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)50 μmol/L IRW預(yù)處理細(xì)胞0.5 h后，可以保護(hù)細(xì)胞免受H2O2氧化損傷，此時(shí)細(xì)胞存活率提高了15.7%。

2.4 CSPH4對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力

CSPH4可使細(xì)胞存活率提高可能與其降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。因此，用H2O2構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，測(cè)得細(xì)胞內(nèi)ROS水平如圖3所示。

圖3 氧化應(yīng)激條件下玉米大豆蛋白水解物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力的影響Fig.3 Intracellular ROS scavenging capacities of corn soybean protein hydrolysate under conditions of oxidative stress in cells induced by H2O2

從圖3中可看出，與對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著(P<0.05)升高。與氧化應(yīng)激組相比，經(jīng)不同濃度(0.05～2.00 mg/mL) CSPH4處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組相比，經(jīng)CSPH4處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組無(wú)顯著(P>0.05)差異。因此，CSPH4能有效降低H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.5 CSPH4對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性的影響

采用熒光探針(DCFH-DA) 法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，DCFH-DA可被細(xì)胞膜上的酯酶脫乙酰基水解成DCFH，DCFH可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，AAPH自由基經(jīng)激發(fā)后可使細(xì)胞內(nèi)DCFH氧化成具有綠色熒光的DCF。若有抗氧化物質(zhì)存在，其可通過(guò)減少過(guò)氧化自由基的產(chǎn)生從而降低熒光強(qiáng)度。CSPH4對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，無(wú)論是Trolox還是CSPH4都可以抑制DCF熒光的增加，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。根據(jù)公式算出CAA活性值，以濃度為橫坐標(biāo)，CAA活性值為縱坐標(biāo)，繪制劑量效應(yīng)曲線如圖5所示。根據(jù)圖5計(jì)算出Trolox和CSPH4的EC50值分別為0.733和8.968 mg/mL，此時(shí)，CSPH4的CAA值為(48.08±2.05) μmol TE/100 g。在CAA實(shí)驗(yàn)中，Caco-2可以吸收CSPH4來(lái)清除有AAPH產(chǎn)生的過(guò)氧自由基，減少DCF的形成，降低細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的Trolox的EC50值與文獻(xiàn)中的值接近[20]。CSPH4的CAA活性值要比藍(lán)莓、蔓越莓、蘋果和紅葡萄等在HepG2細(xì)胞中CAA活性值高，但略低于綠葡萄CAA活性值[18]。存在的這些差異可能是由于這些抗氧化劑的主要成分與本實(shí)驗(yàn)中肽的主要成分不同導(dǎo)致的，而且不同的細(xì)胞之間也會(huì)有不一樣的CAA活性值[22]。

圖4 Trolox(A)和CSPH4(B)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of Trolox(A) and CSPH4(B) on cellular fluorescence intensity

圖5 Trolox(A)和CSPH4(B)的CAA活性值Fig. 5 The CAA value of Trolox(A) and CSPH4(B)

3 結(jié)論

本文研究了米曲霉種曲和堿性蛋白酶順序協(xié)同水解玉米大豆蛋白復(fù)配物的條件、玉米大豆蛋白水解物的抗氧化能力及氧化應(yīng)激條件下對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力。玉米大豆蛋白水解物具有良好的抗氧化活性，降低氧化應(yīng)激條件下Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量，在食品工業(yè)中具有成為良好抗氧化劑的潛力。