牛類芽孢桿菌BD3526產α-葡萄糖苷酶抑制劑的條件優化

韓瑨，吳正鈞，劉振民，趙勇

1(上海海洋大學 食品學院，上海,201306)2(上海乳業生物工程技術研究中心，乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海,200436)

Ⅱ型糖尿病，又稱非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，簡稱NIDDM)，由胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷造成，患者體內的胰島素水平表現為正常或高于正常人水平，由于NIDDM無癥狀或癥狀少，因此往往會被忽視而在病人體內進一步呈隱匿性發展，正因為如此，NIDDM的發病率顯著高于其他糖尿病(Ⅰ型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊類型糖尿病)[1]，占糖尿病總數的85%以上。在臨床上，可通過胰島素增敏劑、促胰島素分泌劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑等藥物手段緩解或治療NIDDM[2]。

在目前的NIDDM治療藥物品類中，α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor，簡稱AGI)因其療效佳、副作用小而被病患視為首選的口服降糖藥物。盡管自然界中AGI來源廣泛，植物(如大豆[3]、中草藥[4]等)、動物(如海洋無脊椎動物[5]等)和微生物[6]中均有過報道。與前兩者相比，增殖生長更迅速的微生物有AGI積累快、得率高的特點，因而微生物來源的AGI成為目前市售主要糖尿病藥物，如阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)以及米格列醇(Miglitol)，都是真菌類微生物的代謝產物或次級代謝產物[7]。但到目前為止，受到可參考分離手段相對有限等不利因素的影響，安全性更有優勢的細菌類微生物(如乳酸菌等)AGI依然未得到有效的開發與應用。

前期研究發現，脫脂乳經BD3526發酵(培養時間36 h，培養溫度30℃，脫脂乳濃度為10%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL)后對α-葡萄糖苷酶的抑制活性較強(半數抑制濃度IC50為22.4 mg/mL)，為了進一步提高目標抑制物的產量,以利于后續的分離提取工作順利開展，本文以半數抑制濃度為響應值IC50，先后采用單因素法和響應面法確定培養時間、培養溫度、脫脂乳濃度和三角瓶裝量的優選值，接著驗證響應面預測模型的可靠性，并與優化前IC50進行了比較。

1 材料與方法

1.1 菌種與實驗材料

PaenibacillusbovisBD3526，由光明乳業股份有限公司提供。

M17瓊脂培養基、M17液體培養基、乳糖,英國OXOID LTD.;脫脂乳粉，光明乳業股份有限公司；NaOH、Na2CO3、乳酸，國藥集團化學試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、pNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)，美國Sigma公司，MRS培養基，德國merck公司；TPY培養基，海博生物科技有限公司。

1.2 培養基的制備

脫脂乳培養基的制備：將質量分數2.0%～10.0%脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，120 ℃滅菌20 min，即得所需濃度的無菌脫脂乳培養基。

1.3 儀器與設備

HVE-50型高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺,美國THE BAKER COMPANY公司；AVANTI J30I型高速冷凍離心機,美國BECKMAN COULTER公司；HZQ-F160型搖床,蘇州培英實驗設備有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱,上海精宏實驗設備有限公司；PHS-25型pH計,美國奧立龍公司；XW-80A型漩渦混合儀,上海青浦滬西儀器廠；Spectra Max M5多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司；FreeZone 12型真空冷凍干燥機,美國LABCONCO公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 發酵種子的制備

將牛類芽孢桿菌BD3526的凍干粉以少量無菌蒸餾水溶解，用接種環挑取一環劃線于M17蔗糖瓊脂培養基(以50 g/L蔗糖取代M17培養基中5 g/L的乳糖，在120 ℃下滅菌20 min)上，28 ℃好氧培養24 h后取出，用接種環挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養基中，采用渦旋混合儀將細胞均勻分散后，28 ℃、180 r/min搖床培養48 h取出，再以體積分數2%接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養基中，再次于28 ℃、180 r/min搖床培養48 h，將培養物以15 000 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀部分以無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養體積的無菌蒸餾水懸浮，得到發酵用的種子。

1.4.2 待測樣品的制備

將發酵乳置于沸水浴中滅活10 min，取出冷卻至室溫，以10 000 r/min離心2 min后取上清，以1 mol/L NaOH回調pH至6.80，再次10 000 r/min離心2 min后取上清，將冷凍干燥后所得粉末溶解于PBS(0.1 mol/L，pH 6.80)的緩沖液中，即得不同質量濃度(80、40、20、10和5 mg/mL)的待測樣品。

1.4.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性及IC50的測定

在體外測定模型PNPG法[8]的基礎上加以改良：向1.5 mL EP管內分別加入100 μL待測樣品與50 μL α-葡萄糖苷酶(100 mU/mL)，混合均勻后于37 ℃水浴15 min，再加入80 μL PNPG(2 mmol/L)，混勻后再次37 ℃水浴15 min，最后加入80 μL Na2CO3(0.2 mol/L)終止反應。將上述反應體系于4 ℃、10 000 r/min離心2 min后，取200 μL上清液于96孔微孔板中，利用酶標儀在405 nm下測定吸光度。取3次平行實驗OD405的平均值，代入公式(1)計算α-葡萄糖苷酶抑制活性：

式中：陰性對照組為PBS替代待測樣品組中的待測樣品；陰性空白組為PBS替代陰性對照組中的α-葡萄糖苷酶；樣品空白組為PBS替代待測樣品組中的α-葡萄糖苷酶。

IC50的測定：以樣品濃度為橫坐標，糖苷酶抑制率為縱坐標作圖，通過回歸方程擬合并計算可得該樣品抑制α-葡萄糖苷酶半數活性所需的濃度，即IC50。

1.4.4 單因素實驗

1.4.4.1 培養時間對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按體積分數2%接種量接入裝有50 mL 10%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養，并于不同的培養時間(12、24、36、48、60 h)取出發酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測樣品，再按1.4.3所述方法測得各樣品的IC50。

1.4.4.2 培養溫度對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分數)接種量接入裝有50 mL、10%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，分別置于20、25、30、35和40 ℃條件下，180 r/min搖床培養48 h，取出發酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測樣品，再按1.4.3所述方法測得各樣品的IC50。

1.4.4.3 脫脂乳濃度對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分數)接種量接入裝有50 mL，濃度分別為2%、4%、6%、8%和10%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養48 h，取出發酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測樣品，再按1.4.3所述方法測得各樣品的IC50。

1.4.4.4 三角瓶裝量對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分數)接種量分別接入裝有25、50、75、100和125 mL，10%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養48 h，取出發酵乳(n=3)，按1.4.2所述方法制備成待測樣品，再按1.4.3所述方法測得各樣品的IC50。

1.4.5 響應面實驗

為了確定BD3526產AGI的最佳條件，在上述單因素實驗的基礎上，進一步以培養時間(A)、培養溫度(B)、脫脂乳濃度(C)、三角瓶裝量(D)4個因素為自變量，IC50為響應值，采用Box-Behnken響應面法(response surface methodology，RSM)設計中心組合實驗，因素與水平見表1。

表1 響應面因素與水平表Table 1 Factors and levels of RSM

1.4.6 驗證與比較實驗

根據RSM法獲得的優選條件以及優化前的方法制備發酵乳并測定IC50，對響應面預測值進行驗證，同時比較條件優化前后的BD3526產AGI的效果差異。

1.4.7 數據統計分析

采用Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計、數據分析及回歸模型建立，運用Origin Pro 2016、Excel 2013 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 培養時間對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分數)接種量接入裝有50 mL 10%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養，培養不同時間(12、24、36、48、60 h)后獲得的發酵乳IC50如圖1所示。

圖1 培養時間對BD3526產AGI的影響Fig.1 Effect of fermentation time on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

在BD3525接種后的12～60 h內，發酵乳IC50呈現先下降后上升的變化趨勢，在發酵前期(12～48 h)，隨著培養時間的延長，IC50緩慢下降，各時間點的IC50分別為：35(12 h)、26.8(24 h)、22.4(36 h)、20.3 mg/mL(48 h)，表明BD3526代謝產生的AGI正隨著發酵程度的加深而逐步積累，當培養時間延長至60 h時，IC50并未進一步降低，反而顯著升高(42.4 mg/mL)，說明前期積累的AGI被迅速消耗，可能的原因是：(1)發酵后期(48～60 h)的體系中營養物質已趨于貧乏，前期積累的代謝產物被視為營養來源而被菌株加以利用；(2)菌株為了維持必要的生境而分解過度積累的代謝產物。類似的AGI合成特點在其他同類研究中也常被提及，例如范文婭等[9]發現，接種LC2W培養96 h后獲得的發酵乳對糖苷酶抑制效果最佳，但隨著發酵時間的進一步延長，其體外降糖效果會逐步降低，因此，推測發酵時間的延長導致發酵前期代謝產生的抑制劑被利用或被菌體裂解產生的胞內酶破壞。鑒于48 h發酵乳的IC50最低，因此，后續實驗均采用48 h作為最適培養時間。

2.1.2 培養溫度對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液以2%(體積分數)接種量接入50 mL 10%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，分別置于20、25、30、35和40 ℃條件下，180 r/min搖床培養48 h后獲得的發酵乳IC50如圖2所示。

圖2 培養溫度對BD3526產AGI的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

培養溫度對BD3526產AGI能力的影響較大，不同樣品組的IC50差異較大。其中，40 ℃發酵乳的糖苷酶的IC50最高(47.2 mg/mL)，20 ℃發酵乳的IC50次之(36.1 mg/mL)，說明過低(20 ℃)或過高(40 ℃)的培養溫度均不利于AGI大量合成或積累，而在30 ℃條件下制備的BD3526發酵乳的IC50最低(20.3 mg/mL)，表明30 ℃為BD3526代謝脫脂乳產AGI的優選培養溫度；此外，該條件與類芽孢桿菌家族其他菌株(如多粘類芽孢桿菌[10]等)的最適生長條件基本吻合[11]，所以，由糖苷酶抑制活性與菌體生長的正相關性推測可得，AGI極有可能是該菌株生長過程中的代謝產物之一。

2.1.3 脫脂乳濃度對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分數)接種量接入裝有50 mL，質量分數分別為2%、4%、6%、8%和10%脫脂乳培養基中， 30 ℃、180 r/min搖床培養48 h后獲得的發酵乳IC50如圖3所示。

圖3 脫脂乳濃度對BD3526產AGI的影響Fig.3 Effect of skimmed milk concentration on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

當脫脂乳濃度較低(質量分數2%)時，BD3526發酵乳的IC50較高(20.2 mg/mL)，說明合成的AGI較少，這可能是發酵體系中的營養成分相對不足造成的。將脫脂乳質量濃度增加至40 g/L時發酵乳IC50達到最低(16.8 mg/mL)，表明此時BD3526合成與積累AGI的效果最佳。然而，繼續增加脫脂乳濃度并未對AGI的產量有進一步促進作用，6%、8%以及10%(質量分數)的脫脂乳培養基制備而得的發酵乳所對應的糖苷酶IC50分別為：17.9、19.4和20.3 mg/mL，導致這種現象的原因：(1)增加的營養成分(脫脂乳)促進了菌體的大量增殖，迅速富集的有害代謝產物影響了AGI的生物合成；(2)脫脂乳濃度的增加提高了發酵體系的滲透壓，高滲環境對菌體的正常代謝有一定影響。考慮到脫脂乳濃度4%(質量分數)的發酵乳IC50最低，故選用4%為最適脫脂乳濃度。

2.1.4 三角瓶裝量對BD3526產AGI的影響

將BD3526種子液按2%(體積分數)接種量分別接入分別裝有25、50、75、100和125 mL，4%(質量分數)脫脂乳培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養48 h后獲得的發酵乳IC50如圖4所示。

圖4 三角瓶裝量對BD3526產AGI的影響Fig.4 Effect of amount of medium per flask on AGI-production of Paenibacillus bovis BD3526

BD3526是最近發現的一株類芽孢桿菌新種[12]，為典型的好氧菌，因此，發酵體系的通氣狀況直接影響BD3526的生長狀態與目標代謝物的產量。若三角瓶裝量過多，則發酵體系通氣不足，AGI的產量會因菌株生長不充分而降低，相反地，若裝量過少，又會因菌體過度生長使原本用于合成AGI的營養物質被快速消耗殆盡。由圖4分析可知，裝量為25、75、100和125 mL/250 mL時制備的發酵乳IC50相對較高，分別為18.7、19.1、21.5和23.4 mg/mL，前者屬于裝量過少的情況，后三者是裝量過多所致，裝量50 mL/250 mL時所制備發酵乳的IC50最低(17 mg/mL)，因此為本實驗的優選裝量。

2.2 響應面實驗

2.2.1 Box-Behnken響應面實驗及回歸分析

利用Box-Behnken響應面法對多變量發酵體系中的研究因素(培養時間、培養溫度、脫脂乳濃度、三角瓶裝量)和評價因素(IC50)的相關性和及其相互影響進行分析，通過軟件(Design Expert 8.0.6)推算建立二次回歸數學模型，進而獲得優選的發酵因素組合。

根據Box-Benhnken中心組合實驗的原理，設計N=29的4因素3水平的響應面分析實驗，其中析因點24個，區域中心零點的重復實驗5個。具體實驗的設計與結果如表2所示。

表2 響應面設計與結果Table 2 Design and results of RSM

續表2

實驗號自變量響應值ABCDIC50/(mg·mL-1)19-10102020101038210-10-121.822010-128230-10121.62401012825000016.826000016.927000016.82800001729000016.9

進一步利用Design Expert 8.0.6對表2數據進行回歸分析，得到多元二次響應面回歸模型：IC50(mg/mL)=16.88+8.98A+3.08B-1.50C-0.075D+0.075AB-0.30AC+0.40AD-0.025BC+0.05BD-0.18CD+11.04A2+ 6.11B2+ 2.56C2+ 2.14D2。該模型的R2=0.998 4，調整R2=0.996 8，說明回歸方程與數據的擬合度較高，可解釋99.68%實驗所得結果。二次響應面回歸模型的方差分析結果見表3。

表3 二次響應面回歸模型的方差分析結果Table 3 Variance analysis results of the quadratic response surface regression model

注：*表示顯著，P<0.05；**表示極顯著，P<0.01

該模型顯著(模型P值<0.0001)，且無失擬因素存在(失擬項P值為0.178 6>0.05)。各因素的交互作用對IC50的影響順序為：AD(0.116 5)>AC(0.230 1)>CD(0.476 2)>AB(0.758 4)>BD(0.837 3)>BC(0.918 2)，其中，部分因素的交互作用(A和B、C和D)對IC50的影響如圖5所示。

A-培養溫度和培養時間的交互作用；B-脫脂乳濃度和三角瓶裝量的交互作用圖5 培養溫度和培養時間、脫脂乳濃度和三角瓶裝量的交互作用對IC50的影響Fig.5 The effect of the interactions of cultivation temperature and cultivation time, skimmed milk concentration and amount of medium per flask on IC50

由圖5可知，各因素在所選范圍均存在響應最高點，這與表3中模型的顯著性結果一致。根據二次回歸模型的預測，當培養時間為43.04 h、培養溫度為29.39 ℃、脫脂乳濃度為4.85%、三角瓶裝量為52.43 mL/250 mL時，菌株BD3526發酵乳的最低IC50可達14.6 mg/mL。綜合考慮了后續驗證實驗的可操作性，對上述優化條件進行修正：培養時間為43 h，培養溫度為29 ℃，脫脂乳濃度為5%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL。

2.2.2 驗證與比較

為驗證優化實驗預測結果的可靠性，在上述優選條件下制備BD3526發酵乳(n=3)，并測定糖苷酶的IC50，同時與優化前的條件(培養時間為36 h，培養溫度為30 ℃，脫脂乳濃度為10%、三角瓶裝量為50 mL/250mL)所制備的發酵乳進行比較，結果如圖6所示。

圖6 驗證與比較實驗結果Fig.6 Results of the validation and comparison experiments

驗證后發現：(1)優化條件下實測的BD3526發酵乳IC50均值為15.1 mg/mL，基本與模型預測值(14.6 mg/mL)保持同一水平；(2)優化后的實測IC50值比優化前(22.4 mg/mL)降低了33%，上述結果表明響應面法對BD3526發酵乳制備工藝的條件優化是有效的。

3 結論與討論

BD3526是1株從西藏生牦牛乳中分離得到的類芽孢桿菌，經生理生化、16S rDNA等分類數據的比較后發現，該菌株為1株類芽孢桿菌新種，命名為Paenibacillusbovis(牛類芽孢桿菌)，為該種的模式菌株[12]。隨后，圍繞BD3526的各類研究相繼展開。杭鋒等發現，BD3526可代謝小麥麩皮產生一種高活性的凝乳酶[13-14]，并進一步研究了該金屬蛋白酶的分離純化過程[15]、結構預測[16]及其對乳蛋白的水解位點的影響[17]。BD3526能利用多種培養基(麩皮[18]、無氮培養基[19]、半合成培養基[20])合成具有特定生物活性(增強免疫)的胞外多糖(Levan等)，兼具抑菌[21-22]、促生長[23]等積極的益生功能。近期研究發現，脫脂乳經BD3526發酵(培養時間為36 h，培養溫度為30 ℃，脫脂乳濃度為10%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL)后對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度IC50為22.4 mg/mL，為進一步提高目標抑制物的產量以利于后續的分離提取工作順利開展，本文對培養條件進行了優化。

本文首先采用單因素實驗確定了培養時間、培養溫度、脫脂乳濃度和三角瓶裝量的優選值，分別為48 h、30 ℃、4%和50 mL/250 mL，在此基礎上，再利用響應面法考察了各因素的相互作用對α-葡萄糖苷酶IC50的影響，結果發現，當培養時間為43 h，培養溫度為29 ℃，脫脂乳濃度為5%、三角瓶裝量為50 mL/250 mL時，BD3526發酵乳的IC50為15.1 mg/mL，進一步地驗證與比較實驗顯示，實際值與理論值(14.6 mg/mL)基本一致，比優化前(22.4 mg/mL)降低了33%。