復合無硫抑制劑對中華管鞭蝦中多酚氧化酶的協(xié)同作用機理

郝云彬，相興偉，周宇芳，夏文水*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山，316000)

2016年我國水產(chǎn)品的總產(chǎn)量為4 920萬t，居世界首位[1]。但由于蝦體內(nèi)富含水分及蛋白質(zhì)，在加工貯藏過程中極易腐敗變質(zhì)，尤其是發(fā)生黑變[2]。黑變是由于蝦體內(nèi)富含的多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)使表面酪氨酸等色原物質(zhì)發(fā)生氧化，經(jīng)過一系列生化反應(yīng)生成了黑色素[3]。

水產(chǎn)品添加劑的使用直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量安全。長期以來，我國普遍依賴亞硫酸鹽來抑制蝦類黑變的發(fā)生[4]。但是，亞硫酸鹽的使用容易引發(fā)食品安全問題[5-6]。歐盟、日本等都嚴格規(guī)定了蝦肉中SO2殘留不得超過0.1 mg/g[7]。另外，發(fā)達國家已率先研發(fā)出相對安全的4-己基間苯二酚(4-Hexylresorcinol，4-HR)來抑制蝦類黑變的發(fā)生[8]。這可能會成為影響我國海水蝦類出口的重大技術(shù)壁壘。因此，引進國外海水蝦酚酶抑制劑，研發(fā)不同食品添加劑的協(xié)同防黑變新技術(shù)，對于解決產(chǎn)品質(zhì)量安全，提升我國水產(chǎn)品國際市場競爭力，增加漁民收入和漁業(yè)增效具有十分重要的意義。

本文針對包括前期研究的4種主要的酚酶抑制劑成分：4-HR、檸檬酸、抗壞血酸以及乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na)，分析影響多酚氧化酶活力的主因子及雙因子效應(yīng)，用降維法得出偏回歸解析子模型，對酶活抑制效果尋優(yōu)；研究了2種抑制因子對海水蝦酶促褐變的抑制效果以及抑制類型，通過分子動力學模型探究復合抑制劑的抑制機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-己基間苯二酚(4-Hexylresorcinol，4-HR)、L-抗壞血酸(食品級)、左旋多巴(Levodopa，L-DOPA)(分析純)，美國Sigma-Aldrich公司；丙酮、KH2PO4、K2HPO4、無水(NH4)2SO4等(分析純)、Tris-HCl緩沖液，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 海水蝦多酚氧化酶的制備

選擇東海區(qū)海捕蝦主要品種中華管鞭蝦為研究對象，其多酚氧化酶的制備采用XIANG[9]的方法。

1.3 方法

1.3.1 不同抑制因子組合的交互作用試驗設(shè)計

采用丁希泉[10]的方法稍作修改。以4-HR、檸檬酸、抗壞血酸與EDTA-2Na作為抑制因子，目標函數(shù)為多酚氧化酶活力，結(jié)合酚酶抑制特性研究的相關(guān)文獻，設(shè)計如表1所示的因素水平表。每個水平的抑制因子先配制成一定濃度的50 mL處理液備用。

1.3.2 PPO酶活力測定方法

參照NIRMAL[11]的方法并略有改進。以L-DOPA為特異性底物，將相應(yīng)濃度的處理液1 mL與0.5 mL的L-DOPA混合均勻，再加入0.5 mL PPO以及1 mL Tris-HCL緩沖液，45 ℃保溫10 min，再加入預(yù)冷的純水3 mL，混勻后在490 nm波長處測定吸光度變化，測定6 min，每1 min吸光值增加0.001定義為1個酶活力單位。

表1 效應(yīng)分析中參試抑制因子水平編碼表 單位：mmol/L

1.4 多酚氧化酶活力抑制因子的抑制機理

1.4.1 抑制因子對多酚氧化酶活力的抑制作用

將新提取的酶液與不同濃度的抑制因子混合，然后在冰箱中4 ℃靜置0.5 h，2種抑制因子在反應(yīng)體系中的終濃度如下：EDTA-2Na為0、0.6、1.0、1.4、1.8 g/L，檸檬酸為0、1、3、5、7 g/L，再加入0.01 mol/L的L-DOPA為底物。酶活測定方法同1.3.2，空白對照組以1 mL超純水代替抑制因子。酶被抑制因子處理前后酶活性變化以剩余酶活百分比表示。酶促反應(yīng)體系達到穩(wěn)定態(tài)后，吸光度隨時間延長的線性段直線外推得到的橫截距為遲滯時間。

1.4.2 抑制因子對多酚氧化酶活性的抑制類型

以L-DOPA為底物，在不同底物濃度下，測定不同濃度的EDTA-2Na與檸檬酸對PPO酶活的抑制效果。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，判斷不同抑制劑的抑制類型。其中L-DOPA底物的濃度均為0.001、0.003、0.005、0.008、0.010 mol/L，酶活測定方法同1.3.2。

1.5 抑制因子的分子結(jié)構(gòu)化學動力學研究

采用ChemBioOffice Ultra軟件，利用分子動力學模型MM2力場，基于量子化學的分子動力學計算方法對酶抑制反應(yīng)路徑進行多次模擬優(yōu)化，利用密度泛函理論計算各反應(yīng)路徑中穩(wěn)態(tài)和過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和能量，并對分子模擬結(jié)果進行驗證[12-15]。依此預(yù)測各抑制動力學流程及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化特征，探討2種抑制因子的抑制機理。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，正交試驗結(jié)果采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Excel 2007軟件繪圖。采用ChemBioOffice Ultra軟件進行分子動力學模擬計算，并繪制反應(yīng)流程圖及結(jié)構(gòu)變化示意圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑制因子組合對甲殼類多酚氧化酶活力的影響

按表1中參試抑制因子水平進行多酚氧化酶酶活抑制試驗，試驗和分析結(jié)果見表2和表3。

表2 各參試因子試驗結(jié)構(gòu)矩陣及測試結(jié)果Table 2 Structure matrix and results of each test

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

2.2 影響多酚氧化酶活力的主因子效應(yīng)分析

表4 主因子效應(yīng)值Table 4 Principal factor effect value

2.3 響應(yīng)面曲面分析

通過響應(yīng)曲面分析得到X1X4、X3X4、X2X3的偏回歸解析子模型為：

圖1是模型的響應(yīng)曲面，從中可以直觀地看出，當檸檬酸和抗壞血酸的用量處于低編碼值水平時，隨著4-HR用量的增加，酶活力下降；當檸檬酸和抗壞血酸處于較高編碼水平時，4-HR濃度的提高卻最終導致酶活力有增加趨勢，說明高濃度的檸檬酸將顯著削弱4-HR的作用效果。當EDTA-2Na處于較低編碼值水平時，隨著抗壞血酸用量的增加，酶活力下降；但當EDTA-2Na處于較高編碼水平時，抗壞血酸導致酶活性的下降趨勢緩慢，說明高濃度的EDTA-2Na對抗壞血酸的抑制效果有削弱作用。

2.4 酶活抑制效果的模擬尋優(yōu)

采用數(shù)學模擬對響應(yīng)面進行分析的結(jié)果表明，當4-HR、抗壞血酸、檸檬酸、EDTA-2Na的質(zhì)量濃度分別為0.46～0.68、0.01～0.018、4.85～7.20、1.58～2.90 mg/mL時，多酚氧化酶的酶活可抑制在14以下，抑制率達60%以上。

2.5 多酚氧化酶的抑制機理

2.5.1 抑制劑對多酚氧化酶酶促反應(yīng)的影響

從圖2可以看出，隨著檸檬酸和EDTA-2Na質(zhì)量濃度的增加，多酚氧化酶的催化活性均逐漸降低。在反應(yīng)中沒有抑制劑時，反應(yīng)的遲滯時間分別為126.34、135.23 s；當體系中檸檬酸和EDTA-2Na質(zhì)量濃度分別達到1.8 g/L時，酶的活力均降至45.8%，遲滯時間分別達到1094.65 s和1186.65 s。呂敏等也發(fā)現(xiàn)，在多種抑制劑中，檸檬酸和EDTA對中華管鞭蝦PPO活性抑制作用較強[16]。

a-檸檬酸(X1)與4-HR(X4)的雙因子效應(yīng)分析；b-抗壞血酸(X3)與4-HR(X4)的雙因子效應(yīng)分析； c-EDTA-2Na(X2)與抗壞血酸(X3)的雙因子效應(yīng)分析圖1 各因素交互作用等高線和響應(yīng)面Fig.1 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction

圖2 抑制因子對多酚氧化酶的酶活力和遲滯時間的影響Fig.2 Effects of inhibiting factor on the enzyme activity and hysteresis time of phenol oxidase

2.5.2 抑制劑對多酚氧化酶的抑制類型

從圖3可以看出，檸檬酸與EDTA-2Na抑制PPO催化底物的反應(yīng)中，反應(yīng)的最大速率不變，但是米氏常數(shù)隨抑制劑濃度的增大而增大，說明2種因子同底物競爭性地與酶結(jié)合。

a-檸檬酸對多酚氧化酶的抑制類型Lineweaver-Burk作圖;b-EDTA-2Na對多酚氧化酶的抑制類型Lineweaver-Burk作圖圖3 檸檬酸以及EDTA-2Na對多酚氧化酶的抑制類型Fig.3 Effect of citric acid on phenol oxidase

2.6 兩種抑制因子抑制機理探討

多酚氧化酶是多亞基的含銅金屬酶，每個亞基含2個金屬銅離子，它們分別與蛋白質(zhì)分子中2個平展的組氨酸和1個弱的直立組氨酸配體結(jié)合，另有1個內(nèi)源橋基將2個銅離子聯(lián)系在一起，構(gòu)成多酚氧化酶催化氧化反應(yīng)活性中心[17]。根據(jù)分子軌道理論，檸檬酸和EDTA-2Na與多酚氧化酶結(jié)合的穩(wěn)態(tài)最小能量為458、450 kcal/mol，而這一能量數(shù)值與底物鄰苯二酚(463 kcal/mol)相近，表明檸檬酸和EDTA-2Na與鄰苯二酚可能構(gòu)成直接競爭關(guān)系。

檸檬酸羧基活性高，可與多酚氧化酶結(jié)合。同時，該類絡(luò)合物既能發(fā)生分子內(nèi)絡(luò)合，也可與另一個檸檬酸分子實現(xiàn)分子間絡(luò)合。這兩類反應(yīng)都具有很低的絡(luò)合能量(122～139 kcal/mol)，生成的化合物較為穩(wěn)定。因此，檸檬酸與多酚氧化酶活性體生成的高穩(wěn)定性單體會降低多酚氧化酶與底物的接觸濃度，從而發(fā)揮抑制作用。由于檸檬酸抑制體系是分子力學上動態(tài)的可逆反應(yīng)，體系的反應(yīng)程度有限，所以檸檬酸只能發(fā)揮有限的抑制作用，并不能徹底防止黑變的發(fā)生。當EDTA-2Na分子上一個羧基與多酚氧化酶絡(luò)合后，該分子上的另一個羧基更傾向于與多酚氧化酶絡(luò)合，因為這種絡(luò)合態(tài)能量更低(分子內(nèi)絡(luò)合能量值為167 kcal/mol，而分子間絡(luò)合能量值為197 kcal/mol)。由于EDTA-2Na易解離和接受氫離子，氫離子濃度對EDTA-2Na的絡(luò)合影響很大，通過調(diào)節(jié)氫離子的濃度可以實現(xiàn)EDTA-2Na的可逆絡(luò)合反應(yīng)。EDTA-2Na與檸檬酸的作用機理類似，體系的反應(yīng)程度有限，僅能夠有限地抑制黑變的發(fā)生。

圖4 檸檬酸與EDTA-2Na抑制多酚氧化酶化學原理圖Fig.4 Chemical schematic diagram of citric acid and EDTA-2Na inhibiting phenol oxidase

2.7 復合抑制劑對多酚氧化酶抑制機理分析

2.7.1 4-HR與抗壞血酸的抑制機理[18-20]

4-HR、抗壞血酸均能抑制海水蝦多酚氧化酶活性。它們與PPO雙銅活性中心的初始結(jié)合能量較低，通過競爭性結(jié)合活性中心發(fā)揮抑制效果。在反應(yīng)過程中，4-HR與PPO會生成一種高穩(wěn)定絡(luò)合物，持續(xù)有效地消耗PPO，降低酶與底物的接觸濃度，在較大程度上抑制黑變?？箟难釀t存在2種作用機制，一方面能通過與多酚氧化酶活性中心絡(luò)合，直接對PPO酶產(chǎn)生抑制作用；另一方面能通過還原中間產(chǎn)物醛類，抑制黑色素的生成。

2.7.2 抑制因子交互作用機理分析

復合抑制劑主要作用組分之間存在交互效應(yīng)，其中低濃度的檸檬酸、抗壞血酸與4-HR存在一定的正交作用；而高濃度的檸檬酸、抗壞血酸會削弱4-HR的抑制效果。檸檬酸與抗壞血酸酸性較強，容易解離出氫離子，可作為較強的親核試劑進攻多酚氧化酶活性中心。同時，它們的結(jié)構(gòu)變型性好、空間位阻小，更容易與多酚氧化酶結(jié)合，這一點可以從分子力場軌道模型的最小穩(wěn)態(tài)能量得到體現(xiàn)(檸檬酸、抗壞血酸、4-HR與酶結(jié)合的最小能量分別是458、461和463 kcal/mol)。同時，檸檬酸和抗壞血酸的結(jié)合是可逆的，所以在高濃度條件下，它們會降低4-HR與多酚氧化酶的接觸濃度從而削弱4-HR的抑制效果。至于高濃度EDTA-2Na對抗壞血酸的抑制作用也有削弱效果，可能由于高濃度的EDTA-2Na與抗壞血酸較強的氫鍵絡(luò)合作用降低了抗壞血酸與多酚氧化酶的接觸濃度。

2.7.3 復合抑制劑抑制機理探討

4種抑制因子與多酚氧化酶雙銅活性中心的初始結(jié)合能量大小接近，均易與多酚氧化酶活性中心結(jié)合，起到抑制效果。其中4-HR幾乎不可逆地與多酚氧化酶結(jié)合，持續(xù)有效地消耗多酚氧化酶，較大程度上抑制黑變。而抗壞血酸、檸檬酸和EDTA-2Na與多酚氧化酶則形成動力學上的可逆平衡，因此只能在一定程度上抑制黑變。

在復配體系中，4-HR的溶解是一個動態(tài)平衡過程，其他組分的存在，有利于提高4-HR的離子化水平，保障其有效作用濃度。同時抗壞血酸、檸檬酸與EDTA-2Na均呈酸性，可解離出一定濃度的氫離子，適量氫離子的存在，能增強4-HR與其他組分的氫鍵配位絡(luò)合效應(yīng)，進而提高4-HR的水溶性。

綜上所述，復合抑制劑中4-HR通過與多酚氧化酶形成高穩(wěn)定的絡(luò)合物來主導抑制效果，適量檸檬酸、抗壞血酸、EDTA-2Na的存在，既可通過銅絡(luò)合發(fā)揮抑制作用，也可提高4-HR的氫鍵配位絡(luò)合能，從而實現(xiàn)復合抑制劑的高抑制效果。

3 結(jié)論

(1)4種抑制劑的抑制能力從大到小依次為4-HR、抗壞血酸、檸檬酸和EDTA-2Na。高濃度的檸檬酸、抗壞血酸將顯著削弱4-HR的作用效果，高濃度EDTA-2Na也會削弱抗壞血酸的抑制效果。當4-HR、抗壞血酸、檸檬酸、EDTA-2Na的質(zhì)量濃度分別為0.01～0.018、0.46～0.68、4.85～7.20、1.58～2.90 mg/mL時，復合抑制劑的抑制率達60%以上。

(2)4種因子均同底物競爭性地與酶結(jié)合。復合抑制劑中4-HR通過與多酚氧化酶形成高穩(wěn)定的絡(luò)合物來主導抑制效果，適量檸檬酸、抗壞血酸、EDTA-2Na的存在，既可通過銅絡(luò)合發(fā)揮抑制作用，也可提高4-HR的氫鍵配位絡(luò)合能，從而實現(xiàn)復合抑制劑的高抑制效果。但在高濃度條件下，檸檬酸和抗壞血酸會降低4-HR與多酚氧化酶的接觸程度，從而對4-HR抑制作用起到了削弱效果。