GTSF1在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞生物學特性的影響

米凱 黃銳（通訊作者）

（1 核工業四一六醫院＜成都醫學院第二附屬醫院＞普外科 四川 成都 610501）

（2 四川省醫學科學院·四川省人民醫院 四川 成都 610072）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種致死率較高的惡性腫瘤，發病率一直居高不下，嚴重危害人類的生活健康。僅有少數肝癌患者被明確診斷時具有手術的機會，且術后存活期短，多數肝癌患者通常預后較差，并伴有高轉移風險、易復發等[1]。目前，尋找新的治療靶標及有效治療手段迫在眉睫，且在分子水平了解肝癌發病機制，對發現潛在的診斷和治療靶點，從而對肝癌的早期診斷和治療提供實驗基礎具有重要意義。配子體特異性因子1（GTSF1）基因參與生殖細胞中的DNA甲基化和反轉錄轉座子活化，特別是在細胞增殖期間[2]。本文旨在評估肝癌組織中GTSF1基因表達的水平，以及其在人肝癌細胞系中的作用，為肝癌發生的分子病因及肝癌診斷和治療提供方向。

1.資料與方法

1.1 對象

選擇2016年1月－2018年12月四川省醫院4例術后肝癌組織標本及其癌旁組織（距離肝癌組織5cm以上）標本。均簽署知情同意書，經四川省醫院倫理委員會批準。

1.2 實時熒光定量PCR檢測

采用RNA提取試劑盒（Invitrogen）提取結肝癌組織、癌旁組織總RNA，測定A260和A280吸光度值，電泳確定RNA的完整性后，依據mRNA反轉錄試劑盒說明，合成cDNA，用PCR儀擴增，實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對GTSF1 mRNA表達進行相對定量。

1.3 細胞培養及轉染

HepG2肝癌細胞（南京凱基生物）在含10%胎牛血清、含1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養基中，置于溫度37℃、含5%CO2培養箱培養，取對數生長期細胞，根據所轉染的siRNA的不同分成對照組、NC-siRNA組和GTSF1 siRNA組，分別轉染GTSF1的siRNA，NC的siRNA，37℃孵育48h后收集所有細胞。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力

取收集的細胞，按照CCK-8檢測試劑盒（北京索萊寶生物）說明檢測，將各實驗組細胞按每孔3×103個細胞接種于96孔板，加入100μL完全培養液于37℃、含5%CO2培養箱，培養48h后，每孔加入10μL CCK-8，繼續培養4h后用酶標儀檢測各組細胞在450nm處的吸光度值（A），細胞增殖活力（%）=（A實驗組-A對照組）/A對照組×100%。

1.5 流式細胞技術檢測細胞凋亡

取收集的細胞，按Annexin V-PI說明書（北京索萊寶生物）檢測，各實驗組細胞以5×105/mL的密度接種于6孔板中，培養48h后取出6孔板，用PBS清洗細胞表面殘留的培養液，常規重懸后加入AnnexinV APC、7-AAD，輕輕搖動，使其混合均勻，室溫避光孵育15min，上流式細胞儀（美國BD）檢測，總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 GTSF1表達水平

RT-PCR結果顯示，癌旁組織中GTSF1 mRNA表達顯著低于肝癌組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 GTSF1 mRNA表達

2.2 細胞增殖、凋亡比較

細胞增殖結果顯示GTSF1 siRNA組細胞增殖顯著低于NC-siRNA組及對照組（P＜0.05），細胞凋亡結果顯示GTSF1 siRNA組細胞凋亡顯著高于NC-siRNA組及對照組（P＜0.05），見表、圖2。

表 不同處理組細胞增殖、凋亡比較

圖2 細胞凋亡

3.討論

肝癌（HCC）與肺癌、胰腺癌一起被稱為病死率最高的三大癌癥。我國是肝癌高發大國，世界上將近一半的新發肝癌患者在中國，且發病率近年居高不下，而HCC的發生是一個復雜多步驟過程，涉及調節基因中遺傳和表觀遺傳改變的積累。癌癥相關分子的鑒定可能導致治療的新分子靶標和預測預后的生物標志物的發展。因此，多種遺傳和表觀遺傳因素可能影響HCC的發展[3]。已有研究報道，GTSF1基因參與生殖細胞中的DNA甲基化和反轉錄轉座子激活，特別是在細胞增殖中，并且它存在于MF腫瘤樣品中，表明它可能在MF的細胞凋亡抗性中發揮作用[4]。同時，GTSF1基因可以在各種生理過程中起到增殖因子的作用[5]。就肝癌而言，已有許多關于與肝癌發展相關的分子標志物的研究，并且已經通過腫瘤組織的基因表達譜確定了具有診斷和預后潛力的基因標記[6]。本結果中，確定肝癌組織樣品中GTSF1 mRNA表達較其在相鄰的非腫瘤肝組織中表達明顯增加（P＜0.05），提示GTSF1可能參與肝癌發生，其表達水平可能是肝癌診斷的潛在生物標志物。

在腫瘤發展期間，腫瘤標志物的數量、類型、分布和表達水平與腫瘤密切相關，然而，尚缺乏理想的腫瘤標志物用于肝癌的診斷和預后的評價[7]。研究表明GTSF1在肝細胞瘤細胞系中經常上調，且GTSF1可在體外增加集落形成，證明GTSF1促進體內腫瘤生長。所有這些數據都強調了GTSF1在腫瘤發生中的基本作用，特別是在肝癌的發展中。因此，GTSF1表達可能在體內HCC腫瘤細胞的增殖中起關鍵作用[2]。為了探索GTSF1的作用，采用siRNA轉染腫瘤HepG2細胞，觀察GTSF1基因對細胞增殖及凋亡的影響，結果顯示GTSF1 siRNA組細胞增殖顯著低于NC-siRNA組及對照組（P＜0.01），GTSF1 siRNA組細胞凋亡顯著高于NC-siRNA組及對照組（P＜0.05）。表明GTSF1的過表達參與調節肝癌細胞增殖、增加致癌性。

綜上所述，GTSF1基因在肝癌發生的分子病因學中具有重要作用，提示GTSF1 mRNA表達在肝癌診斷和治療中的潛在應用。由于所涉及的病例數量相關的限制，并且患者均來自本研究中的單個區域，GTSF1 mRNA和蛋白質表達在肝癌中的功能還需進一步觀察。