復(fù)方雙參顆粒抗氧化活性與抗衰老作用研究

侯會芳，袁震徽，王振波，姜麗萍,關(guān)洪斌,姜志輝*，黃建軍*

（1.參園莊生物科技股份有限公司，威海264211；2.威海博源園林管理有限公司，威海264211；3.山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，威海264209）

人參來源于五加科人參屬植物人參Panax ginsengC.A.Mey的干燥根，主產(chǎn)于我國東北，尤以吉林省產(chǎn)量最大，質(zhì)量最佳，是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，大補(bǔ)元?dú)猓哂邪俨葜醯姆Q號。人參根據(jù)加工方法不同，分為鮮人參、生曬參、紅參等產(chǎn)品。《本經(jīng)》：人參“主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智。中國藥典記載：人參大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智。用于體虛欲脫，肢冷脈微，脾虛食少，肺虛喘咳，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，氣血虧虛，久病虛贏，驚悸失眠，陽痿宮冷。近代研究表明：人參具有抗衰老、抗疲勞、抗氧化、抗癌、改善人體免疫力和提高記憶力等作用[1]。

海參屬于海參綱（Holothuroidea），是生活在海邊至8000米的海洋棘皮動物，距今已有6億多年的歷史，海參以海底藻類和浮游生物為食。海參全身長滿肉刺，廣布于世界各海洋中。中國南海沿岸種類較多，約有20余種海參可供食用。海參同人參、燕窩、魚翅齊名，是世界八大珍品之一。海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材。據(jù)《本草綱目拾遺》中記載：海參，味甘咸，補(bǔ)腎，益精髓，攝小便，壯陽療痿，其性溫補(bǔ)，足敵人參，故名海參。海參具有提高記憶力、延緩性腺衰老，防止動脈硬化以及抗腫瘤等作用。

自Harman創(chuàng)立自由基學(xué)說以來，人們對自由基的產(chǎn)生及其對機(jī)體的危害有了更加深刻的認(rèn)識，各種疾病如癌癥、臟器損傷、衰老、炎癥等都與自由基有著密切關(guān)系。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)衰老的“元兇”就是自由基——在人體的新陳代謝過程中不斷產(chǎn)生的帶有不對稱電子的原子或分子。自由基侵害人體細(xì)胞產(chǎn)生致衰因子mda，致衰因子mda進(jìn)一步侵害細(xì)胞生成脂褐素，脂褐素沉積在人體細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷。隨著對天然產(chǎn)物的研究越來越多，人們發(fā)現(xiàn)一些天然產(chǎn)物具有抗氧化作用，一些補(bǔ)益滋養(yǎng)類的中藥具有抗氧化作用。中藥抗氧化及與人工合成的抗氧化劑相比較，具有高效、經(jīng)濟(jì)、毒副作用小等明顯的優(yōu)點(diǎn)，近年來，國內(nèi)外學(xué)者在研究中藥抗氧化等作用方面取得了顯著成績。為了更好的開發(fā)利用參園莊高麗紅參，我們對復(fù)方雙參顆粒抗氧化活性和抗衰老作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海滬西分析儀器廠）；TDL-5臺式離心機(jī) (上海科興儀器有限公司）；XW-80A漩渦混合器（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 （北京醫(yī)療電子儀器廠）；722型紫外可見分光光度計 （上海光譜儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

參園莊高麗紅參（將進(jìn)口韓國高麗鮮人參，采用韓國紅參加工工藝和中國紅參加工技術(shù)相結(jié)合制備而成），配伍威海產(chǎn)海參、昆布、核桃、黑豆、黑芝麻、燕麥、胡蘿卜、無花果、大棗、適量麥芽糊精制成復(fù)方雙參顆粒。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

總抗氧化 （T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（試劑盒均購于南京建成生物工程研究所）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物：

清潔級(SPF)昆明種小鼠（山東綠葉制藥有限公司），雄性，體重 18～22g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組制劑的制備

取復(fù)方雙參顆粒100g，加入其重量的8倍水提取3h，過濾，濾液備用；濾渣再加6倍水提取2h，過濾，濾液備用；濾渣再加4倍水提取1h，過濾,合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液至1 g·mL-1，置4℃冰箱保存，備用。

2.2 動物分組與給藥

取健康雄性小鼠80只，隨機(jī)分為復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組、空白對照組，每組40只。采用灌胃方式給藥，每日1次，自由攝食與飲水，連續(xù)給藥20 d，給藥體積20 mL·kg-1，空白對照組給予等體積的蒸餾水。

2.3 體內(nèi)抗氧化活性的 （T-AOC能力、SOD活性、MDA含量）測定

末次灌胃給藥30min后，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組隨機(jī)各抽取10只小鼠，采用負(fù)重游泳模型，致小鼠力竭游泳后，脫頸處死，立即取同部位的一小塊肝臟，稱重，冰浴下勻漿制備成10%肝臟勻漿液，以3000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清，按照試劑盒上的說明測定肝臟勻漿中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。

計算公式為：

總抗氧化（T-AOC）能力（U/mgprot）=（測定管吸光值-對照管吸光值）÷0.01÷30×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)÷所測樣本蛋白含量

公式中：0.01：在37℃時，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系吸光度值每增加0.01，為1個總抗氧化能力的單位；30：體系反應(yīng)時間為30min。

超氧化物歧化酶（SOD）活性（U/mgprot）=（測定管吸光值-對照管吸光值）÷對照管吸光度÷50%×反應(yīng)液總體積÷取樣量÷組織中蛋白含量

丙二醛（MDA）含量（nmol/mgprot）=（測定管吸光值-測定空白管吸光度）÷（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷組織中蛋白含量

以上各實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SSPS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并且采用方差分析檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以±s表示，P＜0.05和P＜0.01都代表所得數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2.4 體外抗氧化活性的測定

體外抗氧化活性的測定采用對O2-·、·OH的清除能力進(jìn)行測定，與Vc比較，確定其體外抗氧化活性；羥基自由基的測定參照樊青玲[1]方法，計算清除率；超氧陰離子的測定按文獻(xiàn)（Ozsoy et al.2008）方法，計算清除率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 實(shí)驗(yàn)組影響運(yùn)動后小鼠體內(nèi)抗氧化作用的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組能增強(qiáng)體內(nèi)超氧化物歧化酶SOD的活性，降低由于脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的丙二醛MDA含量，實(shí)驗(yàn)組總抗氧化T-AOC能力顯著高于對照組（P＜0.01），結(jié)果見表 1。

表1 復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組影響小鼠肝臟組織中SOD活性、MDA含量及總抗氧化T-AOC能力的結(jié)果

3.2 復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組影響體外抗氧化活性的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組對羥基自由基和氧自由基均有清除作用（P＜0.05），且與Vc比較，實(shí)驗(yàn)組對羥基自由基的清除效果要好于對超氧陰離子自由基的清除效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方雙參顆粒實(shí)驗(yàn)組影響羥基自由基和超氧陰離子自由基的結(jié)果

4 討論

生物體內(nèi)最常見的自由基是氧自由基，而氧自由基主要包括超氧陰離子自由基（O2-·)、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等。自由基學(xué)說認(rèn)為，機(jī)體高強(qiáng)度或長時間運(yùn)動時，體內(nèi)會產(chǎn)生自由基，過多的自由基會破壞體內(nèi)氧化攻擊和抗氧化保護(hù)的平衡。因此一般通過對上述自由基的清除能力來鑒定藥物的體外抗氧化活性。當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動時，抗氧化酶的清除作用有限，體內(nèi)產(chǎn)生自由基會逐漸積累，正常的生理狀態(tài)下，機(jī)體代謝產(chǎn)生的自由基會被體內(nèi)的一些抗氧化酶和非酶成分如超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽等清除，從而達(dá)到一個穩(wěn)定的狀態(tài)。在抗氧化指標(biāo)的檢測中，采用了體外和體內(nèi)兩種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，可以更加充分的說明復(fù)方雙參顆粒抗氧化能力。動物實(shí)驗(yàn)表明，如果人為地把生物體中的SOD基因“敲除”掉，這些生物的壽命就會縮短。而如果提高身體里面SOD的水平，這些生物的壽命就會延長一些。但是增加SOD并不會使生物體“永生”，說明衰老還有其他機(jī)制。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方雙參顆粒對羥基自由基和超氧陰離子自由基均有明顯的清除作用。體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方雙參顆粒可以提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性，降低氧化物丙二醛的含量，具有良好的抗氧化能力，進(jìn)而提高抗衰老作用，這與復(fù)方雙參顆粒中含有的皂苷類、多糖類等成分有關(guān)[2～6]。

實(shí)驗(yàn)證明復(fù)方雙參顆粒在抗氧化活性和抗衰老作用方面具有廣闊的開發(fā)前景，為中藥復(fù)方在抗氧化活性和抗衰老作用領(lǐng)域進(jìn)行更深入廣泛的人體研究和開發(fā)利用提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。