貝參特牌西洋參三七膠囊對氫化可的松所致免疫低下小鼠的影響

袁小平，謝 勇，劉 焱，蒲學明，于曉風，李沅耕，睢大筼*

（1.吉林省北域西洋參研究有限公司，長春130000；2.吉林大學藥學院，長春130021）

貝參特牌西洋參三七膠囊（APC）是利用西洋參提取物、三七粉和靈芝破壁孢子粉組方研制的一種用于提高免疫力的保健食品。西洋參（PanaxquinquefoliumL.）為五加科人參屬植物，原產于美國和加拿大，國內多個地區已廣泛種植。研究表明，西洋參莖葉皂苷通過增強T淋巴細胞轉化，具有免疫增強與調節作用，可能與促進T淋巴細胞產生IL-2、IFN-γ表達有關[1]。西洋參水煎液可顯著提高小鼠遲發型超敏反應的強度和單核吞噬細胞能力[2]。 三七 [Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科植物三七的干燥根和根莖。研究表明，三七水煎劑可提高單核巨噬細胞系統的活性，對SRFC和PFC均有促進作用[3]。三七皂甙在細胞免疫功能、體液免疫功能和NK細胞等方面具有明顯的增強作用[4]。破壁靈芝孢子粉能提高細胞免疫力和體液免疫力，提高免疫球蛋白和補體的含量，誘導干擾素的生成，激活自然殺傷細胞和巨噬細胞活性，增強免疫器官胸腺、脾臟、肝臟的重量，從而增強人體對各種疾病的抵抗能力[5，6]。本文觀察APC對小鼠特異性及非特異性免疫功能的調節作用，為其開發利用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級ICR雄性小白鼠，體重18.0～22.0g，吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK-（吉）2007-0003。實驗溫度為 24℃， 濕度為60%。

1.2 藥品與細胞

西洋參三七膠囊由吉林省北域西洋參研究有限公司提供，批號：20190815；氫化可的松（2mL/支），河南潤弘制藥股份有限公司生產，批號：1704171；Yac-1小鼠淋巴瘤細胞系細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組給藥及模型建立

200只清潔級ICR雄性小鼠隨機分為對照組、模型組及西洋參三七膠囊（APC）低、中、高劑量組，每組40只。對照組及模型組每日灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉20ml/kg，藥物組分別灌胃給予APC 0.25、0.5、1.0g/kg，每日1次，連續灌胃30天。除對照組外，各組均于給藥第24、26、28、30天皮下注射氫化可的松40 mg/kg，建立小鼠免疫功能低下模型。

2.2 觀測指標

2.2.1 小鼠抗體生成能力實驗

于給藥第27天，各組10只小鼠腹腔注射5%（v/v）雞紅細胞懸液0.2mL進行免疫，第31天，眼球取血，1500 r/min離心5min，取血清，用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋后的血清0.5mL與5%（v/v）雞紅細胞懸液0.25mL，10%（v/v）補體 0.25mL 混勻，于恒溫箱中 37°C孵育30min，置4°C冰箱中30min終止反應。1500 r/min離心5min，取上清液200μL加入平底96孔板中，在酶標儀540nm下測OD值。另設不加血清的空白孔作為對照孔，以OD值作為判定血清溶血素水平的指標。

2.2.2 小鼠T淋巴細胞轉化能力實驗

于第31天，各組10只小鼠眼球取血，2000 r/min離心10 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書測定血清中TNF-α、IL-6含量。無菌取脾，用含10%小牛血清的1640培養液制成細胞濃度為1×107/ml脾細胞懸液。在平底96孔培養板中每孔加入100μl上述細胞懸液。每只小鼠設3副孔，加100μl 1640培養液。另設ConA刺激3副孔，每孔加入100μl上述脾細胞懸液及100μlConA（終濃度為 5μl/ml）。 置于 37°，5%CO2培養箱中孵育44h后每孔加入MTT 10μl（終濃度5mg/ml），繼續置于37℃，5%CO2培養箱中孵育4h。棄上清，每孔加入DMSO 100μl，微型震蕩器震蕩至結晶完全溶解。酶標儀570nm長下測量OD值，計算刺激指數SI。SI=刺激孔OD值/對照孔OD值。

2.2.3 小鼠NK細胞活性實驗

于第31天，各組10只小鼠無菌取脾，制成脾細胞懸液。取處于對數生長期的靶細胞Yac-1細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液調整細胞濃度為2×105個/mL。U型96孔板中，試驗孔加入細胞濃度為1×106個/mL脾細胞懸液100μL，每只小鼠設3復孔，加入靶細胞Yac-1細胞懸液100μL。另設效應細胞對照孔3復孔，加入細胞濃度為1×106個/mL脾細胞懸液100μL及RPMI1640培養液100μL。設靶細胞Yac-1細胞對照孔3復孔，加100μL靶細胞懸液及RPMI1640培養液，37℃孵育4 h后，1000 r/min離心5 min，每孔棄上清液100μL，加入MTT溶液10 μL，置于37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱中孵育4 h。孵育結束后2500 r/min離心5 min，棄上清。每孔加入DMSO 100μL，微型振蕩器振蕩至結晶完全溶解，酶標儀570 nm下讀數，計算NK細胞活性，以殺傷率表示。殺傷率（%）=[1-（實驗組OD值-效應細胞OD值）/靶細胞 OD 值]×100%。

2.2.4 小鼠巨噬細胞吞噬功能實驗

于第31天，各組10只小鼠尾靜脈注射用生理鹽水稀釋10倍的印度墨汁0.1 mL/10g，分別于注射后1 min及5 min從小鼠內眥靜脈采血20μL，溶于2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中，以酶標儀680 nm處測量OD值。并于第二次采血后脫臼處死小鼠，取胸腺、脾臟和肝臟準確稱重，以胸腺、脾臟和肝臟重量（mg）/體重（10g）計算胸腺、脾臟和肝臟系數，按下列公式計算吞噬指數k和吞噬活性a。

2.3 統計方法

數據的統計處理采用SPSS 13.0統計軟件中單因素方差分析進行均值比較，實驗數據以±S表示，采用組間比較t檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性。

3 結果

3.1 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠臟器系數及巨噬細胞吞噬功能的影響

與對照組比較，模型組小鼠臟器系數及巨噬細胞吞噬能力均明顯降低 （P＜0.01）。與模型組比較，APC 0.5、1.0g/kg均能明顯提高小鼠胸腺和脾臟系數，增強吞噬指數K和吞噬活性α（P＜0.05 或P＜0.01），0.25g/kg組對小鼠胸腺、肝臟和脾臟系數，吞噬指數K和吞噬活性 α 均無明顯影響（P＞0.05），結果見表 1、2。

表1 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠臟器系數的影響（±s，n=10）

表1 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠臟器系數的影響（±s，n=10）

與對照組比較 ##P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01

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表2 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響（±s，n=10）

表2 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響（±s，n=10）

與對照組比較 ##P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01

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2.2 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠淋巴細胞轉化、NK細胞活性及血清溶血素的影響

與對照組比較，模型組小鼠T淋巴細胞刺激指數，NK細胞殺傷率及血清溶血素生成OD值均明顯降低（P＜0.01）。 與模型組比較，APC 0.5、1.0g/kg 能明顯提高小鼠T淋巴細胞刺激指數，NK細胞殺傷率及血清溶血素生成OD值 （P＜0.05或P＜0.01），0.25g/kg對小鼠T淋巴細胞轉化、NK細胞活性及血清溶血素生成均無明顯影響（P＞0.05），結果見表3。

表3 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠淋巴細胞轉化、NK 細胞及溶血素的影響（±s，n=10）

表3 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠淋巴細胞轉化、NK 細胞及溶血素的影響（±s，n=10）

與對照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

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2.3 對氫化可的松致免疫低下小鼠血清TNF-α及IL-6含量的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α及IL-6水平均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，APC 0.5、1.0g/kg均能明顯提高免疫功能低下小鼠血清TNF-α及 IL-6 水平（P＜0.05 或P＜0.01），0.25g/kg對小鼠小鼠血清TNF-α 及IL-6水平均無明顯影響 （P＞0.05），結果見表4。

表4 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠血清TNF-α 及IL-6含量的影響 （±s，n=10）

表4 APC對氫化可的松致免疫低下小鼠血清TNF-α 及IL-6含量的影響 （±s，n=10）

與對照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01

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3 討論

免疫系統主要由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成。中樞免疫器官包括胸腺和骨髓，外周免疫器官包括脾臟、淋巴結和黏膜免疫系統。胸腺、脾臟可最直觀地體現機體的免疫功能。當病原體進入并攻擊人體后，巨噬細胞及自然殺傷細胞等固有免疫細胞會釋放細胞因子來刺激適應性免疫的激活[7]。在適應性免疫應答中，抗原特異性淋巴細胞增殖并分化成能夠消除病原體的T淋巴細胞和B淋巴細胞，這樣免疫系統可以在病原體再次攻擊時產生更快速、有效的反應[8]。NK細胞是參與固有免疫的重要成員，無需預先致敏即可破壞受損的細胞和某些腫瘤細胞，應答速度快，在免疫應答早期即可發揮作用[9]。在抗原進入機體并被免疫系統識別后，可從淋巴細胞抗原受體庫中將結構與其互補的細胞克隆挑選出來，并進一步激活，從而產生特異性抗體，而通過對抗體生成能力進行檢測，即可評價相應的體液免疫功能[10]。當T淋巴細胞受ConA刺激后部分小淋巴細胞轉化為不成熟的母細胞，進行有絲分裂發生母細胞增殖反應，可使用MTT比色法檢測母細胞的增殖率來表示T淋巴細胞的轉化率，進而評價細胞免疫功能[11]。本研究結果表明，APC可明顯提高氫化可的松致免疫功能低下小鼠脾臟和胸腺的臟器系數，增強免疫功能低下小鼠巨噬細胞的吞噬能力，提高NK細胞的殺傷活性、T淋巴細胞轉化率及血清溶血素和TNF-α和IL-6細胞因子水平，提示其可有效增強固有免疫、適應性免疫應答強度，提高細胞因子水平，對小鼠非特異性及特異性免疫功能均具有增強作用。