自制與市售豆瓣中的酵母菌分離與分析

羅睿星　謝義鵬

摘? 要：酵母菌是食品釀造過程中的重要微生物，能代謝產(chǎn)生多種有利于食品安全或風(fēng)味的化合物。豆瓣是四川地區(qū)重要的釀造食品，但關(guān)于酵母菌在其中的作用研究較少，該研究對自制和市售的樣品使用平皿劃線法進(jìn)行菌種分離純化，分離獲得了兩株形態(tài)不同的酵母菌，利用平皿菌落計數(shù)法對獲得的酵母菌計數(shù)，通過顯微鏡對菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。結(jié)果表明：豆瓣中存在數(shù)量較多的酵母菌，無論是自制還是市售的豆瓣，其含有的大量酵母菌是其具有獨特酯香、醇香的物質(zhì)基礎(chǔ)來源，也證明了在傳統(tǒng)的風(fēng)味食品中酵母菌起著至關(guān)重要的作用。

關(guān)鍵詞：豆瓣? 酵母菌? 純化? 菌落

中圖分類號：Q936 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2019）07（b）-0195-03

Abstract： Yeast is an important microorganism in the food brewing process and can be metabolized to produce a variety of compounds which are beneficial to food safety or flavor. Watercress is an important brewing food in Sichuan area. However， there are few studies on the role of yeast in this field. In this study， the self-made and commercially available samples were isolated and purified by using the plate scribing method and two strains of different yeasts were isolated. For the bacteria， the obtained yeasts were counted by a plate colony counting method and the colony morphology was observed by a microscope. The results showed that there were a large number of yeasts in the watercress. Whether it was homemade or commercially available watercress， the large amount of yeast contained in it was the basis of its unique ester and mellow substance which also proved to be in traditional flavor foods.

Key Words： Watercress; Yeast; Purification; Colony

酵母菌是釀造食品中的重要微生物，葡萄酒、果酒、啤酒、白酒等酒類飲品中的醇香、酯香主要來源于酵母菌的發(fā)酵，面包、饅頭等食品制作中的發(fā)泡來源于酵母菌生長產(chǎn)生的二氧化碳，其他的食品如酵素、泡菜等，酵母菌也起著重要的作用[1]。

豆瓣是四川地區(qū)傳統(tǒng)釀造食品，是川菜中不可缺少的調(diào)味品，具有“紅褐油潤、醬酯香濃郁、味甜醇厚”等特點。豆瓣中的酯香、醇香是否與酵母菌有關(guān)呢？為了解此問題，該實驗選擇了四川地區(qū)常用的兩類豆瓣：家庭自制和企業(yè)生產(chǎn)，計數(shù)其中酵母菌的數(shù)量并分離純化主要的酵母菌。

1? 材料與方法

1.1 材料

家里自制豆瓣（貯存1年）、市售豆瓣（淘寶購，品牌：紹豐和，貯存3年）。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物生產(chǎn)，成分包括麥芽浸粉130.0g/L，氯霉素0.1g/L，pH5.6）

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌計數(shù)

平皿菌落計數(shù)法。

（1）培養(yǎng)基制作。

稱取65.05g培養(yǎng)基，加熱溶解于500mL蒸餾水中，分裝于兩個500mL三角瓶，管口用硅膠塞塞上，再扎上牛皮紙，121℃高壓滅菌15min。

（2）其他用具準(zhǔn)備。

無菌生理鹽水：稱取5.4gNaCl，溶解于600mL蒸餾水中，分別分裝于兩個250mL三角瓶和8支18×180mm的試管，三角瓶中分裝225mL，加入小玻璃珠10個，管口用硅膠塞塞上，再扎上牛皮紙，試管中分裝9mL，管口用硅膠塞塞上，再扎上牛皮紙，121℃高壓滅菌30min。

無菌移液管8支：將10mL的移液管口塞上棉花，用牛皮紙包裹，121℃高壓滅菌30min。

無菌培養(yǎng)皿20個：取直徑9cm的培養(yǎng)皿20套，用牛皮紙包裹（分成兩包），121℃高壓滅菌30min。

無菌藥匙2個：取2個不銹鋼藥匙1個，用牛皮紙包裹，121℃高壓滅菌30min。

（3）樣品稀釋液制備。

將無菌操作間及潔凈工作臺的紫外燈打開照射30min，關(guān)上紫外燈，10min后進(jìn)去操作。準(zhǔn)確稱取豆瓣樣品25g，放入裝有225mL無菌生理鹽水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置搖床上室溫振蕩20min，靜置20～30s，制成10-1稀釋液;再用無菌移液管吸取10-1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，吹吸3次，制成10-2稀釋液;按照此方法，連續(xù)稀釋，制成10-3、10-4、10-5的稀釋液。

（4）平板接種培養(yǎng)。

取10-3、10-4、10-5兩種稀釋度菌液1mL放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)基加熱熔化后冷卻至50℃，迅速倒入平皿，蓋上皿蓋，每皿20～25mL，混合均勻，凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱，溫度為28℃，正放2h后倒置培養(yǎng)3d。每個稀釋度做3個平行樣。

（5）計數(shù)。

選取菌落數(shù)在10-150 CFU的平板，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，3個平行樣菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中酵母菌的數(shù)量。

1.3.2 菌種分離純化

平皿劃線法。

（1）培養(yǎng)基制作。

平皿培養(yǎng)基制作：稱取13.01g培養(yǎng)基，加熱溶解于100mL蒸餾水中，盛于250mL三角瓶，管口用硅膠塞塞上，再扎上牛皮紙，121℃高壓滅菌15min，滅菌鍋自然降溫，降至100℃以下后取出培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻至50℃后在無菌室中以無菌操作趁熱倒入無菌的培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋，每皿15mL，凝固后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，除去培養(yǎng)皿表面的水分。

斜面培養(yǎng)基制作：稱取13.01g培養(yǎng)基，加熱溶解于100 mL蒸餾水中，趁熱分裝于15×150mm的試管，每管5mL左右，管口用硅膠塞塞上，再扎上牛皮紙，121℃高壓滅菌15min，滅菌鍋自然降溫，降至100℃以下后取出培養(yǎng)基，趁熱放在有斜度的實驗臺上，使其凝固后的斜面長度在試管的1/2～2/3，凝固后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱空白培養(yǎng)5d，除去培養(yǎng)基表面的水分，并檢查斜面上有無菌苔生成，如有則棄之不用。

（2）劃線。

挑取1.3.1步驟長出的菌落，在平皿培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)3次，挑取單菌落于斜面培養(yǎng)基上保藏。

（3）形態(tài)觀察。

①菌落形態(tài)觀察[2]。

無菌室中，以無菌操作從菌株斜面上挑取少量菌體劃線在平皿培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)3d，觀察菌落的顏色、形狀等。

②顯微形態(tài)觀察。

無菌室中操作。取一潔凈的載玻片，中央滴一滴無菌生理鹽水，用接種針以無菌操作從培養(yǎng)皿的菌落上，挑取少量菌體，放在載玻片的液滴中，并將菌體挑開，勿使成團，加上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察。物鏡先用20倍，再用40倍，觀察細(xì)胞的形狀、出芽等情況。

2? 實驗結(jié)果

2.1 酵母菌計數(shù)

家里自制豆瓣樣品和市售豆瓣樣品中均存在酵母菌，每克樣品的酵母菌數(shù)均在一百萬以上（見表1），市售豆瓣樣品中菌數(shù)稍低于家里自制樣品，可能因為市售樣品貯存期較長而導(dǎo)致一些菌死亡。

2.2 酵母菌分離純化

在兩個樣品中均分離純化到兩株酵母菌，分別命名為DBY-1、DBY-2。

DBY-1：菌落中等大小，白色，圓形，光滑，濕潤，邊緣整齊。顯微鏡下觀察細(xì)胞圓形或卵圓形，出芽（見圖1）。

DBY-2：菌落較大，白色，毛狀。顯微鏡下觀察細(xì)胞呈柱形，單個或連接成鏈（見圖1）。

3? 結(jié)論

以家里自制豆瓣和市售豆瓣為材料，通過平皿菌落計數(shù)法研究其中酵母菌的數(shù)量，結(jié)果表明兩種樣品中酵母菌的數(shù)量均在百萬以上，市售豆瓣樣品中菌數(shù)稍低于家里自制樣品，可能因為市售樣品貯存期較長而導(dǎo)致一些菌死亡;采用劃線法從兩種樣品中均分離到了兩株形態(tài)不同的酵母菌DBY-1和DBY-2。

酵母菌是食品釀造過程中的重要微生物，能代謝產(chǎn)生多種有利于食品安全或風(fēng)味的化合物，如乙醇和乙酸具有防腐作用，可抑制有害菌的生長，防止食品腐敗;酵母菌還能產(chǎn)生甘油、高級醇、芳香雜醇及酚類、呋喃酮類化合物等，賦予發(fā)酵食品特殊的甜香、果香等風(fēng)味[3]。

豆瓣是四川地區(qū)重要的釀造食品，但關(guān)于酵母菌在其中的作用研究較少，該研究的結(jié)果表明豆瓣中存在數(shù)量較多的酵母菌，并從不同的樣品中分離獲得了兩株形態(tài)不同的酵母菌。無論是自制還是市售的豆瓣，其含有的大量酵母菌是其具有獨特酯香、醇香的物質(zhì)基礎(chǔ)來源，也證明了在傳統(tǒng)的風(fēng)味食品中酵母菌起著至關(guān)重要的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 付俊淑，莊世文，徐丹丹，等.酵母分離株分子鑒定及其揮發(fā)性香氣成分檢測分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（2）：44-48.

[2] Barnett JA， Payne RW，Yarrow D. Yeasts characteristics and identification（酵母菌的特性與鑒定）[M].青島：青島海洋大學(xué)出版社，1991：17-31.

[3] 張倩，楊濤，姚燦，等.郫縣豆瓣中一株耐鹽酵母菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018（30）：1509-1514，1520.