先天性人巨細胞病毒感染對肝臟的損傷作用及相關血清標志物的分析

竇冬冬 張楠 潘峰

人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)在人類中感染率非常高，我國一般人群HCMV抗體陽性率為86%～96%，嬰幼兒期為60～80%。國外報道先天性HCMV感染的發生率約為0.2%～2.0%[1-2]，國內約為0.2%～0.5%[3]。母親孕期將HCMV 傳播給胎兒，輕則隱性感染，重者可造成流產、死胎、畸形、生長受限等不良結局。諸多報道顯示，HCMV是嬰兒肝炎綜合征(Infant hepatitis syndrome，IHS)的主要致病因素[4-6]，然而對于先天性感染HCMV的患者其病毒對肝臟的損傷研究較少，臨床上常因癥狀隱匿或遲發，不易引起重視而錯過干預止損的最佳時機。因此，本研究通過HCMV感染孕鼠，建立先天性HCMV感染的子鼠模型，觀察其肝臟組織病理學改變，并檢測相關血清學指標，為進一步認識先天性HCMV感染對肝臟的早期損傷和早期診斷防治提供參考。

資料與方法

一、一般資料

30只SPF級Wistar大鼠[體質量(200±20)g，購自山東中醫藥大學實驗動物中心]適應性喂養1周后，按雌∶雄=2∶1配對，見栓孕鼠隨機分為感染組和對照組，每組10只(每只單籠飼養)。見栓后2～5 d，感染組大鼠腹腔內接種HCMV-AD169病毒懸液(0.1 mL/只)，對照組腹腔內接種等量的人胚肺細胞上清液(0.1 mL/只)，待其分娩并觀察各組孕鼠及子鼠一般情況。新生子鼠飼養1周后，每籠各取2只(每組20只)進行心臟采血，EDTA抗凝，用于檢測HCMV感染情況。其余子鼠分別于3、5、7周時每組各隨機選取10只心臟采血，留取血清分裝后于-80 ℃冰箱保存。同時留取相應時期肝組織，制作石蠟切片備用。

二、方法

(一)HCMV DNA檢測 采用核酸擴增熒光定量檢測方法，抗凝血液標本分離淋巴細胞并提取DNA，各取上清液5 μL(含病毒DNA)離心后分別加入若干HCMV-PCR反應管，設置PCR程序：93 ℃→2 min預變性，然后按93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s，10個循環，最后按93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30個循環。同時設置陰性質控品和陽性定量質控參考品梯度，記錄數據。檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司。

(二)病理學檢查 對生后3、5、7周時兩組隨機選取的新鮮子鼠肝臟組織迅速固定、常規脫水及石蠟包埋，切片、烤片，進行HE染色，于光鏡下觀察肝組織普通病理。

(三)檢測血清ALT、肝纖維化指標水平 分別于3、5、7周時應用全自動生化分析儀檢測血清ALT水平。應用大鼠透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ.C)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(均購自北京科碩生物技術有限公司)按照說明檢測血清肝纖維化指標。在反應板樣品孔(設有空白)中加入不同濃度的待測樣品和標準品，37 ℃孵育120 min，再用洗滌液洗滌4～6次并扣干，加入一抗工作液混勻再次溫育、洗滌干燥、避光反應、加終止液檢測吸光值并換算相應含量。

(四)免疫組化檢測肝臟組織α-SMA蛋白的表達 對石蠟切片進行處理并采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物免疫組化試劑盒進行免疫細胞化學染色，一抗(武漢博示德生物技術有限公司)工作濃度均為1∶500，陰性對照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。結果判定：胞漿內出現棕黃色顆粒為α-SMA陽性表達。

三、統計學方法

數據統計分析采用SPSS 20.0 軟件。計量資料以均值±標準差表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、實驗動物一般狀況及子鼠HCMV檢測

(一)一般情況 感染組孕鼠注射病毒懸液后，有萎靡、聳毛、活動減少或躁動、食量減少等表現，子鼠成活率低，皮毛稀疏缺乏光澤，生長發育稍有緩慢，對照組孕鼠及子鼠一般情況良好。

(二)子鼠HCMV檢測 感染組HCMV陽性率為75.0%(病毒載量范圍4.05×103～4.84×107拷貝/mL，平均值4.67×105拷貝/mL)，對照組未見陽性子鼠。先天性人HCMV感染子鼠模型制作成功。

二、肝組織HE染色普通病理鏡檢

感染組子鼠生后3、5、7周時見肝小葉結構紊亂，肝索解離，細胞水腫、變性、壞死，大量淋巴細胞浸潤，肝竇充血明顯。對照組子鼠肝組織病理見肝細胞及肝小葉結構清晰正常，無淋巴細胞浸潤，肝竇無充血(圖1)。

三、血清ALT與肝纖維化指標水平

感染組子鼠在生后3、5、7周，血清ALT、肝纖維化指標水平均表現為高于同時期對照組子鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1～表3。

圖1 肝組織HE染色病理結果

表1 各組子鼠血清ALT測定(±s，IU·L-1)

表2 各組子鼠血清HA、LN測定(±s，ng·mL-1)

表3 各組子鼠血清PCIII、IV.C測定(±s，μg·mL-1)

四、肝組織α-SMA 蛋白表達水平

感染組子鼠3、5、7周肝組織匯管區及增生的纖維組織中α-SMA強陽性表達，肝竇內及肝細胞亦可見陽性表達細胞；對照組子鼠α-SMA主要表達與小動脈及小靜脈，且表達量低(圖2)。

圖2 肝組織α-SMA表達及分布

討 論

HCMV屬于皰疹病毒組DNA病毒，有廣泛的細胞嗜性，普遍易感于人體的多種細胞，可使受感染細胞出現直接損傷；另外，病毒引起的機體免疫病理反應可累及多個器官或系統。本研究中先天性HCMV感染的子鼠出現了一般狀況不良的表現，如存活率低、皮毛稀疏缺乏光澤，生長發育稍有緩慢等。

本研究觀察了先天性HCMV感染的子鼠肝臟病理學改變，結果發現肝組織出現明顯的肝炎樣改變。因肝活檢有創性的特點，少有關于HCMV感染者病理學改變的研究報道。龍梅等[7]曾對50例IHS嬰兒(34例感染HCMV)行B超介導的肝活檢病理檢查，所有患者均存在肝細胞水樣、氣球樣變性以及點、灶性壞死和凋亡小體的形成等表現。與本實驗中先天性HCMV感染的子鼠肝病理學改變類似，表明先天性HCMV感染確實對肝臟具有損傷作用。

血清ALT 和肝纖維化指標是反映肝功能受損，衡量炎癥活動度、纖維化程度的重要指標。在各種病毒性肝炎的急性期、藥物中毒性肝細胞壞死時，ALT可大量釋放入血從而被檢測到。血清肝纖維化指標常被用來間接反映纖維化的程度和輔助診斷，多項報道顯示，患HCMV感染性肝炎的嬰兒血清ALT和肝纖維化指標水平均高于健康嬰兒[6,8]，本研究也發現，先天性HCMV感染的子鼠血清ALT、HA、LN、IV-C、PCIII在肝臟發生損傷的早期即可有顯著升高，可能預示著肝臟的纖維化改變。肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)在致病因素的作用下激活并轉化為肌成纖維細胞(Myofibroblast，MF)，后者表達α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，是肝臟纖維化發生過程中的重要標志蛋白[9]。本研究檢測的感染組子鼠肝組織α-SMA水平高于對照組，提示先天性HCMV感染的子鼠肝臟可能正在發生纖維化改變，也與血清肝纖維化指標結果的意義相符。

綜上，先天性HCMV感染可導致一般狀況發育不良、肝功能受損及纖維化等病理損傷，且在生命早期即可檢測到血清標志物的改變。因此，降低母親孕期感染概率、避免胎兒受到HCMV的感染非常重要，另外，可以通過血清學等手段做好疾病的早期診斷和治療，避免產生不可逆的肝臟病理變化，改善預后。