雷帕霉素抑制肝纖維化病理進程的療效及其機制

肖瀟

我國為慢性乙型及丙型肝炎高發病率國家，易發生肝纖維化[1]。近年來，有報道稱成熟肝細胞上皮間質化與肝纖維化有關；而雷帕霉素體外可抑制肝星狀細胞增殖，體內可抑制四氯化碳致大鼠肝纖維化[2]。本研究探討雷帕霉素對肝纖維化病理進程的抑制作用及其機制。

資料與方法

一、實驗動物

健康雄性清潔級SD大鼠80只，鼠齡3～4個月，體質量230～270 g，由西安交大醫學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(陜)2012-003。

二、 主要儀器與試劑

主要儀器包括Kendro低溫高速離心機(德國Sorvall公司)、DYNEX MRXⅡ型酶標儀(日本Dynex公司)、Olympus光學顯微鏡(日本Olympus公司)、RM6240B多通道生理信號采集處理系統(成都儀器廠)、YP100型壓力換能器(成都儀器廠)、SHHWZICY420型電熱恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)、DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥機(上海精宏公司)、DYY-8型穩壓穩流電泳儀(上海琪特)、Kadok DCs-120凝膠圖像分析系統(美國Life Technologies公司)等。主要試劑包括雷帕霉素(華北制藥股份有限公司，國藥準字H20100079)，E-cadherin、Connexin43、Vimentin、α-SMA等抗體均購自美國Santa Cruz公司，四氯化碳油溶液、組織細胞裂解液、ECL發光增強劑、兔二抗工作液、DAB顯色劑等均購自美國PIERCE公司。

三、 實驗方法

(一)纖維化動物模型制作及用藥 取健康雄性清潔級SD大鼠32只，依據3 mL/kg體質量皮下注射四氯化碳油溶液40 ml/L，2次/周，持續8周，制備四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型。其中，雷帕霉素干預組于第6周同時按2 mg/kg體質量行雷帕霉素灌胃處理，1次/d，維持2周。另取16只大鼠納為正常組。所有大鼠均于第8周處死。

(二)標本獲取及保存 (1)肝臟組織標本：既定時間點處死大鼠，開腹后于腹主動脈取血，完整切離肝臟，分別于各肝葉處取一塊肝臟(厚約4 mm)，甲醛固定、常規脫水、石蠟包埋處理后將剩余肝臟組織切塊，置入凍存管中，于液氮條件下保存；(2)肝細胞提取：以原位加體外循環膠原酶灌注percoll密度梯度離心法，行大鼠肝細胞分離。大鼠腹腔打開后經門靜脈插管，注入肝素鈉抗凝，50 mL注射劑緩慢灌注無鈣D-HANKS液。沖洗肝臟，干凈后0.05%膠原酶液行肝臟原位灌注，速度10 mL/min，2 min后行肝上下腔靜脈結扎，將肝臟取出，行膠原酶液灌注至肝組織變軟、蒼白。肝臟抖動并鈍性分離細胞，200鉑不銹鋼篩網過濾后洗滌，離心處理后獲取肝細胞，置入凍存管，于液氮罐凍存備用。

(三)肝臟組織HE染色 (1)肝臟組織切片：切片前將包埋好的標本置入-20 ℃冰箱冷凍30 min。切片厚度3～5 μm，于普通載玻片上粘附后于60 ℃條件下烘烤，60 min后取出裝盒；(2)HE染色：石蠟切片脫蠟至水，經PBS沖洗、蘇木青染色、鹽酸酒精分化、PBS漂洗等處理后晾干后中性樹膠封片，鏡檢。

(四)肝臟組織中α-SMA表達檢測 (1)載玻片及蓋玻片處理、切片：載玻片洗凈后置入多聚賴氨酸溶液(經1∶10去離子水稀釋)中，浸泡5 min后烘烤裝盒。切片于載玻片上粘附后烘烤裝盒；(2)免疫組化：石蠟切片脫蠟至水，經PBS沖洗、浸泡、滴加二抗工作液、蘇木素復染等處理后中性樹膠封片，鏡檢。采用免疫組化檢測肝組織中α-SMA表達。

(五)蛋白表達檢測 將培養瓶中的細胞用細胞刷刮下后，經勻漿、S-PAGE膠制備、上樣、電泳、轉膜、封閉、結合一抗、洗滌、曝光顯影、定影HRP-ECL發光處理后，運用Epson彩色圖像掃描儀獲取蛋白質信號條帶圖像。采用Western blot測定蛋白表達。

四、觀察指標

分析三組肝臟組織α-SMA染色、HE染色結果，對比三組E-cadeherin、connexin43、Vimentin、α-SMA表達，并觀察三組上皮間質轉化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達，探討雷帕霉素抑制肝纖維化進程中肝細胞上皮間質轉化機制。

五、統計學方法

結 果

一、大鼠肝纖維化模型建立及雷帕霉素干預效果分析

成功建立四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型，模型對照組和雷帕霉素干預組在8周時各有1只死亡，均經α-SMA組化、HE染色證實。經HE染色發現雷帕霉素干預組肝纖維化顯著減輕，經免疫組化行經α-SMA再次驗證。見圖1～2。

正常組肝組織α-SMA陽性細胞(黃褐色)表達少，匯管區(圖P示處)附近門靜脈、肝功靜脈、膽管周圍纖維組織可見；模型對照組肝組織α-SMA陽性細胞表達高于正常組，結構紊亂，于血管周圍可見，且假小葉之間和內部出現α-SMA高表達陽性細胞；雷帕霉素干預組肝組織α-SMA陽性細胞較模型對照組減少，接近正常組，多見于血管、膽管周圍，肉眼分析其總體陽性率接近于正常組陽性率。

圖1三組肝臟組織α-SMA染色

正常組肝組織結構清晰，肝細胞呈條索狀自正常中央靜脈(圖V中示處)向四周放射，肝細胞形呈六邊形，可見清晰肝竇，匯管區(圖P示處)由膽管、門靜脈、肝動脈構成，結構清楚；模型對照組肝組織中結構紊亂，假小葉形成明顯，且小葉間與小葉內均可見大量成纖維細胞(圖F示處)，匯管區及中央靜脈被破壞；雷帕霉素干預組肝組織中成纖維細胞較模型對照組減少，于中央靜脈(圖V示處)處可見，結構不正常，較對模型對照組好轉。

圖2三組肝臟組織HE染色

二、 雷帕霉素抑制肝纖維化進程中肝細胞上皮間質轉化機制分析

模型對照組肝臟中肝細胞內Ⅰ型膠原表達較正常組明顯增高(P<0.05)，上皮標志物E-cadeherin、connexin43表達較正常組明顯減少(P<0.05)，間質細胞標志Vimentin、α-SMA表達較正常組明顯增高(P<0.05)，上皮間質轉化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4較正常組明顯增高(P<0.05)。雷帕霉素干預組肝臟內肝細胞Ⅰ型膠原表達及Vimentin、α-SMA表達較模型對照組顯著下降(P<0.05)，肝細胞E-cadeherin、connexin43表達較模型對照組明顯增高(P<0.05)，p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達較模型對照組顯著下降(P<0.05)，見圖3～5。

Western blot示與正常組相比，模型對照組肝細胞內Ⅰ型膠原表達明顯升高；與模型對照組相比，雷帕霉素干預組Ⅰ型膠原表達明顯下降(甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達較一致，證實總蛋白即上樣量基本相同，重復3次結果一致)。

圖3三組肝細胞內Ⅰ型膠原表達變化

與正常組相比，模型對照組上皮標記明顯減少，間質標記物明顯增多，即E-cadeherin、connexin43表達明顯減少，Vimentin、α-SMA表達明顯增高；與模型對照組相比，雷帕霉素干預組上皮標記物明顯增多，間質標記物明顯減少，即E-cadeherin、connexin43表達明顯增高，Vimentin、α-SMA表達明顯降低(甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參，調整上樣量差異，重復實驗3次，結果基本一致)。

圖4三組肝細胞上皮和間質標記物變化

與正常組相比，模型對照組上皮間質轉化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達明顯增多；與模型對照組相比，雷帕霉素干預組p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達明顯下降(甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參，調整上樣量差異，重復實驗3次，結果基本一致)。

圖5三組肝細胞內上皮間質轉化通路重要蛋白表達變化

討 論

近年來有研究表明，肝細胞上皮間質轉化與肝纖維化有關[3]。Nishikawa等[4]采用TGF-β1處理體外培養所致大鼠成熟肝細胞，發現肝細胞經TGF-β1處理后白蛋白表達明顯下降，Ⅰ型膠原表達上升；而TGF-β1處理后尚存活肝細胞伴上皮間質轉化，推測肝纖維化中肝細胞上皮間質轉化起著重要作用。王川林[5]等發現，肝纖維化中纖維組織母細胞部分源于成熟肝細胞。四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型屬接近肝炎肝纖維化模型。本研究經建立該模型發現，大鼠肝纖維化過程中成熟肝細胞發生上皮間質轉化，E-cadeherin、connexin43表達明顯減少，間質細胞標志Vimentin、α-SMA表達明顯增高，且發現這類肝細胞分泌Ⅰ型膠原增多，預示肝纖維化過程中肝細胞上皮間質轉化發揮著重要作用。本研究發現，肝細胞內上皮間質轉化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4明顯增高，進一步證實肝細胞上皮間質轉化參與肝纖維化過程。

雷帕霉素屬新型免疫抑制劑，其結合FK結合蛋白，使細胞因子與其受體結合后細胞內信號轉導途徑受阻，誘導細胞分化、增殖受抑；其中，磷酸酰肌醇激酶相關激酶調控諸多翻譯元件蛋白合成，在細胞大小、增殖中起著調節作用，多因雷帕霉素靶蛋白(TOR)對mRNA翻譯起始具有調控功能。雷帕霉素作用靶點磷酸酰肌醇激酶相關激酶屬AKT下游重要基因，而AKT已被證實與上皮間質轉化密切相關。AKT-mTOR通路調控細胞體積、侵襲性，而上皮細胞間質轉化后其侵襲性增強、體積增大。臨床證實，雷帕霉素能抑制上皮細胞上皮間質轉化。雷帕霉素提前干預可使細胞體積、侵襲性下降，而此種情況在上皮間質化過程中也存在。目前雷帕霉素被廣泛應用于移植領域，而腎移植術后移植腎臟纖維化屬腎移植術后腎臟慢性失功機制，細胞因子(包括TGF-β1等)引起腎臟近端小管上皮細胞上皮間質轉化，最終誘發肝纖維化。Xiang等[6]通過研究各種免疫抑制劑對TGF-β1所致腎臟近端小管上皮細胞上皮間質轉化的影響，發現雷帕霉素可使上皮間質轉化受抑。而李文文等[7]報道，雷帕霉素體外、體內分別可抑制肝星狀細胞增殖、四氯化碳誘導大鼠肝纖維化。Bridle等[8]發現，雷帕霉素可抑制TGF-β1、CTGF、PDGF表達，上調p27、p21，抑制p70s6k磷酸化，抑制肝纖維化。

本研究發現，雷帕霉素干預組肝細胞較模型對照組更接近正常組織中肝細胞表面標記表達，提示阻斷肝細胞上皮間質轉化是雷帕霉素抑制肝纖維化重要機制。本研究結果顯示，雷帕霉素干預組肝臟內肝細胞Ⅰ型膠原表達及Vimentin、α-SMA、p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達較模型對照組明顯下降，肝細胞E-cadeherin、connexin43表達較模型對照組明顯增高，提示雷帕霉素可下調smad蛋白，而這類蛋白在肝細胞上皮間質轉化中被激活，證實雷帕霉素可能經下調這類蛋白抑制肝細胞上皮間質轉化，從而減輕肝纖維化。