草莓不同生育期根際微生物的動態變化

仝利紅，高 潔，靳永勝 *

(1.北京農學院 a.植物科學技術學院；b.生物科學與工程學院,北京 102206；2. 農業農村部華北都市農業(北方)重點實驗室，北京 102206)

根際是植物根系的表面與土壤親密接觸，并相互產生影響，圍繞在根系表面幾毫米的那部分區域。該區域微生物種群結構和數量的變化會直接影響植物的生長發育，以及對病蟲害不良環境的抵抗能力[1]。根際微生物的多樣性及其豐富度，是植物的第二大基因庫，與植物健康聯系密切。根際微生物是土壤肥力的指標之一。有不少研究表明根際微生物受植物類型及生長發育階段影響顯著，其微生物數量變化隨植物生長發育階段呈現一定的動態變化[2]。

草莓長期連作會使土壤養分失調、微生物區系失衡、土傳病害增加。有研究表明，草莓土傳病害的發生與植物根際微生物群體變化有密切關系[3,4]。研究和掌握不同生育時期草莓根際微生物群體的動態變化規律，有助于及時采取適當的農藝措施防止草莓土傳病害的發生，促進草莓生長。目前還沒有發現關于在草莓不同生育時期根際微生物動態變化方面的研究。本研究中采用 Illumina Miseq 高通量測序技術研究了草莓5個生育時期根際微生物區系的變化規律，為防治草莓土傳病害，保證土壤生態環境的良性循環提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

土壤樣品在2015年11月-2016年5月采自中國農業大學(北京市海淀區上莊鎮)長期種植草莓‘紅顏’定位試驗的溫室大棚內。分別在草莓的恢復生長期、現蕾期、開花和結果期以及盛果期(S1、S2、S3、S4和S5)在大棚內按“S”型挑選9株草莓連根拔起，抖掉根系周圍土壤后裝于滅菌袋內帶回實驗室。每3株視為1個重復，共3個重復?；氐綄嶒炇液?，將每個重復的根際土用毛刷輕輕分別刷入滅菌袋內，然后將3個重復土樣混合，對角線取一半將其作為土壤待測樣品用于分析。將收集的土樣置于-20 ℃保存，用于高通量測序分析。CK則在草莓種植前在溫室內多點采集土壤表層樣品，進行混合后四分法取一半于-20 ℃保存，用于土壤微生物的測定。土壤pH采用電位法測定(水土體積比為5∶1)；土壤有機質采用重絡酸鉀—外加熱法測定；土壤全氮測定采用硫酸—高氯酸消煮—凱氏定氮儀法[5]。試驗地土壤有機質含量26.54 g/kg，全氮含量1.43 g/kg，pH 為7.3。

1.2 土壤DNA提取

稱取0.5 g的土壤使用FastDNA SPIN Kit For Soil(MP Biomedicals，LLC)試劑盒提取基因組DNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮、完整則可直接用于后續試驗。

1.3 MiSeq及數據分析

PCR采用 TransGen AP221-02，PCR為20 μL的反應體系。5×FastPfu Buffer (4 μL); 2.5 mol/L dNTPs (2 μL); 5 mol/L Forward Primer (0.8 μL); 5 mol/L Reverse Primer (0.8 μL); Template DNA (10 ng); FastPfu Polymerase (0.4 μL)，補ddH2O至 20 μL。

1.3.1 細菌16S rDNA PCR擴增反應 用于測序細菌的16S rDNA PCR擴增引物Prime338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，Prime806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應程序：95 ℃ 3 min，27次循環(變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，最后72 ℃ 10 min，10 ℃保存。

1.3.2 真菌18 SrDNA PCR擴增反應 用于測序真菌18S rDNA PCR擴增引物Prime0817F 5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′，Prime 1196R 5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。PCR 反應程序：95 ℃ 3 min，35次循環(變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，最后72 ℃ 10 min，10 ℃保存。

1.3.3 序列分析 利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控后，使用Usearch (http://drive5.com/uparse/)軟件將97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫(SSU123)，設置比對閾值為70%，然后利用mothur (http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)軟件對Ace、Chao1和Shannon指數進行分析。采用R語言vegan包，vegdist和hclust進行距離計算和聚類分析，然后利用R語言進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物學信息分析

對6個土壤樣本的細菌進行測序后共獲得23.7203萬條序列，平均每個樣本獲得3.953 4萬條序列；真菌測序后共獲得23.84萬條序列，平均每個樣本獲得3.973 3萬條序列。使用mothur version v.1.30.1 軟件進行指數分析，用于指數評估的OTU相似水平97%。

表1 細菌和真菌多樣性指數統計表Tab.1 Bacteria and fungi diversity index statistics

由表1可知，細菌Chao1豐富度指數表明土壤中細菌的物種數量隨草莓生長發育的變化而逐漸增多。與對照相比，土壤細菌Shannon指數表明在S1和S3時期下降，在S2、S4和S5時期時上升。細菌Ace指數表明，細菌群落均勻度隨草莓的生長發育逐漸上升。真菌豐富度指數Chao1表明各生育期土壤真菌群落的物種數量與對照樣本相比都有不同程度的增加，尤其在S2時期達到了整個生育期的最大值。真菌Shannon指數表明，只有S2時的真菌群落多樣性升高，其他生育期的真菌群落多樣性都有不同程度的下降。草莓大部分時期的真菌Ace指數均有不同程度增加，特別是在S2時Ace指數達到了整個生育期的最大值，這表明在S2時土壤真菌群落中某些真菌種群發育較好，在群落中的優勢度上升。

2.2 草莓不同生育期根際土壤細菌相對豐度的變化

將草莓 6個土壤樣品質控后序列按97 %相似性進行聚類，共得到 8 091個 OTUs。統計結果分析表明，6個土壤樣品中一共檢測到35個土壤細菌門、82個綱、158個目、283個科、450個屬、818個種。在門水平上，土壤細菌共分為14個類群，整個生育期中細菌相對豐度較高的有Proteobacteria、Acidobacteria、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。隨著草莓的生長發育，土壤細菌主要菌群的相對豐度也發生了明顯變化。與對照相比，Proteobacteria的相對豐度隨著草莓的生長發育而逐漸升高，Acidobacteria的相對豐度隨草莓生育期的變化出現不同程度的下降。

圖1 細菌綱水平柱狀圖Fig.1 Bacteria level histogram

如圖1所示，6個樣品中共檢測到82個綱。相對豐度較高的有酸桿菌綱(Acidobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)。與對照相比，Acidobacteria的相對豐度隨生育期的變化出現不同程度的下降。但是Gammaproteobacteria的相對豐度隨生育期的變化出現不同程度的增加，在S3時期相對豐度達到最高為29.5%。Alphaproteobacteria的相對豐度同樣隨生育期的變化出現不同程度的增加，在S4時期相對豐度達到最高為21.8%。Bacilli的相對豐度只有在S1時期顯著增加，相對豐度達到17.7%，在其他生育時期變化不明顯。Betaproteobacteria的相對豐度只有在S4時期顯著增加，相對豐度達到9.1%，在其他生育時期變化不明顯。

圖2 細菌熱圖Fig.2 Bacteria relative abundanceheatmap

由圖2可知，依據6個樣品細菌分布豐度特征，從屬的水平上進行聚類，分成3類：CK聚成一類(Gl)；S4和S5聚成一類(G2)；S1、S2、S3聚成一類(G3)。從這一結果可以看出各生育時期草莓根際細菌的豐度與非種植草莓的對照土壤有顯著的差異。圖2表明，草莓在整個生育期的細菌具有相似性。在G1土樣中Subgroup_6_norank的相對豐度最高，為26.1%。G2的兩個土樣中，Pseudomonas的相對豐度最高，分別為12.7%和12.1%。另外Bryobacter和Rhodospirillaceae_uncultured多種菌屬在G2的相對豐度也較高，并且這幾種菌屬的相對豐度比其他兩組的豐度高。在G3的3個土樣中Pseudomonas的相對豐度最高，相對豐度分別為18.1%,21.5%和30.9%，而且比其他兩組的相對豐度都要高。在G3的3個土樣中相對豐度較高的還有Bacillus和Flexibacter等，且其相對豐度比其他兩組的豐度高。在G2和G3中，Pseudomonas的相對豐度均是最高，并且G3中的Pseudomonas相對豐度達到了整個草莓生育期的最高。除Pseudomonas外，在G2和G3中分別有多種菌屬的相對豐度比其他兩組要高，屬于其獨特的優勢菌屬。Pseudomonas在草莓整個生育期內都屬于優勢菌，其豐度隨草莓生育期的變化而變化。因此可知，該菌屬在草莓生長發育的不同時期都可能起到重要作用。

2.3 草莓不同生育期根際土壤真菌相對豐度的變化

將草莓不同時期的 6 個土壤樣品質控后序列按97%相似性進行聚類，共得到 23.84萬個 OTUs。6個樣品共檢測到33個土壤真菌門(Phylum)、49個綱(Class)、72個目(Order)、83 個科(Familiy)、95 個屬(Genus)、98個種(Species)。6個樣品共檢測到4個已知真菌門，Ascomycota、擔子菌門(Basidiomycota)、纖毛亞門(Ciliophora)和Choanomonada。6個樣品中，Ascomycota的相對豐度最高，其次分別是Basidiomycota和Ciliophora。Ascomycota的相對豐度隨草莓生育期的變化呈現波動性變化，尤其在S2時期時相對豐度顯著下降。Basidiomycota和Ciliophora的相對豐度隨草莓生育期的變化出現不規則變化，Basidiomycota的相對豐度在S4時期最高；Ciliophora的相對豐度在S2時期最高。

6個樣品中共檢測到51種真菌綱。由圖3可知：相對豐度較高的有糞殼菌綱 (Sordariomycetes)、Ascomycota_unclassified、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)。與對照土樣的相對豐度相比，Sordariomycetes的相對豐度隨草莓生育期的變化出現無規律變化，其相對豐度在S3時期達到最大值為67.3%，在S2時期處于最低值，為35.3%。Ascomycota_unclassified的相對豐度隨生育期的變化逐漸下降。Eurotiomycetes只有在S5時期相對豐度顯著增加(19.6%)，而在其他生育時期無明顯變化。Pezizomycetes在S4時期時相對豐度處于最大值(10.3%)，在S3時期處于最低值(1.6%)。Agaricomycetes在S2和S4時期時相對豐度增加，并且在S4時期時顯著增加達到最大值17.5%。

圖3 真菌綱水平柱狀圖Fig.3 Fungi level histogram

將6個樣品依據真菌分布豐度特征，從屬的水平上進行聚類，通過圖4可以看出，6個樣品明顯地分成3類：CK聚成一類(Gl)；S4、S1和S3聚成一類(G2)；S2和S5聚成一類(G3)。CK聚為一類，而草莓整個生育期聚在一起，表明草莓在整個生育期的真菌具有相似性。在G1中Ascomycota_unclassified和Microascaceae_unclassified相對豐度較高而且比其他兩個組中的相對豐度還要高。相對豐度最高的區域分布在G2；Chaetomium在G2的3個土樣中相對豐度最高，而且比其他兩組的豐度都要高；Chaetomium在G2中的相對豐度達到了草莓整個生育期的最大值，其相對豐度分別為42.4%,45.7%,56.1%。在G3的2個土樣中Chaetomium的相對豐度最高，但豐度低于G2，相對豐度分別為21.1%和26.8%。Chaetomium在草莓整個生育期內都是優勢菌屬，其豐度隨草莓生育期的變化而變化。因此可知，毛殼屬(Chaetomium)對草莓的生長發育有其重要作用。

圖4 真菌熱圖Fig.4 Fungi relative abundance heatmap

3 討論和結論

植物不同生長發育期根系分泌物不同，從而對根際微生物群落結構產生影響，并且隨生育期的變化也呈現一定的動態變化。孫曉棠等采用PCR-DGGE技術對不同生育期番茄根際細菌多樣性進行研究，結果表明根際細菌種類和數量在初花期發生較為顯著的變化，初果期根際群落多樣性指數(H)和物種豐度(S)值都達到最高，微生物最豐富[6]。本研究結果發現土壤細菌和真菌的群落豐富度和多樣性、主要種群的相對豐度隨草莓的生長發育均發生了變化。細菌豐富度隨生育期的變化而逐漸上升；細菌群落多樣性在恢復生長期和開花期時期時下降，現蕾期、結果期和盛果期上升。真菌豐富度和多樣性都在S2時期時顯著升高。這可能是由于在草莓不同生育期根系分泌物的含量和組成不同，使根際微生物的結構和數量發生了改變。草莓生長前期細菌群落多樣性的下降和真菌群體的增加，會導致草莓土傳病害的發生。根據這個現象，在草莓生長前期采取措施促進根際細菌的數量和群體，有利于防止草莓土傳病害的發生。

草莓根際土壤中細菌的相對豐度較高的有Proteobacteria和Acidobacteria。變形菌門的相對豐度隨著草莓的生長發育而逐漸升高，酸桿菌門的相對豐度隨草莓生育期的變化出現不同程度的下降。真菌相對豐度最高的是Ascomycota。Ascomycota的相對豐度隨草莓生育期的變化呈現波動性變化，尤其在S2時期時相對豐度顯著下降。根據土壤細菌熱圖分析，土壤細菌在草莓整個生育期都聚在一起，表明在整個生育期內草莓根際的細菌具有相似性。而且Pseudomonas在草莓整個生育期內都屬于優勢菌。由此推斷，該菌屬在草莓生長發育的不同時期都起到重要作用。Pseudomonas在農業生態系統中發揮著重要作用[7]。它在抑制多種作物疾病[8],促進植物生長發育[9]，降解多種用于植物保護的殺蟲劑[10]等方面均有作用。但是一些假單胞菌也表現出對植物的致病性[11]，使農作物減產。土壤真菌熱圖顯示草莓在整個生育期的真菌具有相似性，并且Chaetomium在草莓整個生育期內都是優勢菌屬。毛殼菌(Chaetomiumspp.)已經被廣泛用于防治由Rhizoctoniasolani和Fusariumoxysporium等引起的松苗猝倒病、Venturiainaequalis引起的蘋果黑星病、Valsamali引起的蘋果樹腐爛病[12]。因此，Chaetomium對草莓的生長發育有其重要作用。