25羥基維生素D濃度及其受體基因多態性與兒童哮喘的相關性研究

朱莉，李建華，馬曉波

(平頂山市第二人民醫院兒科，河南 平頂山，467000)

兒童哮喘的發生嚴重影響了患兒的日常生活質量。流行病學研究顯示，兒童哮喘的發病率可達334～555／10萬人左右[1]，臨床上合并有自身免疫性疾病的人群中，哮喘的發生率可進一步上升[2]。不同的因素均可能影響局部呼吸道平滑肌的痙攣，導致哮喘的發生，特別是細胞因子等的改變，能夠通過加劇局部呼吸道黏膜上皮細胞的代謝、平滑肌的收縮、局部免疫平衡的紊亂等，從而促進兒童哮喘的發生。25羥基維生素D能夠通過影響局部炎癥反應、抑制自身免疫性損傷，穩定T淋巴細胞免疫等，進而參與到哮喘的發生過程中[3，4]。部分研究已經探討并分析了25羥基維生素D在促進哮喘發生過程中的作用，認為25羥基維生素D的表達下降會增加哮喘易感性，導致哮喘治療不佳的重要因素[5，6]，但對于不同25羥基維生素SNP位點多態性的分析研究少見。為了進一步揭示25羥基維生素D多態性在影響兒童哮喘發生過程中的作用，本次研究選取2016年1月至2017年12月在我院治療的哮喘患兒97例，探討了相關指標的表達及其與患者病情的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月在我院治療的哮喘患兒97例(觀察組)，其中輕度哮喘25例，中度哮喘40例，重度哮喘32。納入標準：(1)符合中華醫學會兒科學會呼吸學組制定的兒童哮喘診斷標準；(2)年齡≤12歲；(3)患兒監護人知情同意。排除標準：(1)入院前1周有激素藥物治療史；(2)合并有代謝性疾病、結核、血液系統疾病、急慢性感染等疾病。同時選取100例健康兒童作為對照組，觀察組和對照組一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表 1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 檢測方法 多態性檢測：取凍存的血清保存液體，按照10000r／min的離心速度進行離心分離，每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，進行裂解操作，4°C冰上采用無酶的RNA沖洗液進行洗滌，再次10000r／min離心5min，得到RNA?；旌弦涸诩尤肽孓D錄酶MMLV之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60min，室溫放置5min使其完全溶解，使其逆轉錄為cDNA。以βactin為模版，在反應體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達20ul，上機，反應條件為：93℃2min、93℃ 1min、55℃2min，共40個循環。PCR產物擴增后進行基因多態性檢測：參考multiplexkit試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)使用說明，加入各位點對應延伸引物進行單堿基測序反應。并在ABI1310(Life Technologies，美國)進行電泳，結果用 GENEMAPPER軟件(Life Technologies，美國)進行分析。清晨采集空腹靜脈血，1000r／min 離心 10min，-20℃保存待測，采集標本后1周內檢測25-(OH)-VD水平。采用電化學發光全自動免疫分析儀(美國雅培i2000)及試劑盒，檢測試劑盒購自福建新大陸生物技術有限公司。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS19.0軟件，計量資料采用()表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料比較使用x2檢驗；相關性采用Pearson相關分析。基因型頻率遺傳平衡采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組25-(OH)-VD水平 觀察組25-(OH)-VD明顯低于對照組，差異比較有統計學意義(P＜0.05)，見表 2。

表2 觀察組和對照組25－(OH)－VD水平

2.2 觀察組不同病情患兒25-(OH)-VD和肺功能比較 重度患兒25-(OH)-VD、FEV1和FVC明顯低于中度和輕度患兒(P＜0.05)；中度患兒25-(OH)-VD、FEV1和FVC明顯低于輕度患兒(P＜0.05)。見表3。

2.3 相關性分析 將哮喘患兒25-(OH)-VD與肺功能進行相關分析，結果顯示25-(OH)-VD與FEV1、FVC 呈正相關(r=0.403 和 0.322，P＜0.05)。

2.4 觀察組和對照組VDR基因SNP位點基因型和等位基因分布 觀察組和對照組SNP位點rs2228570、rs1544410和 rs2282679符合 Hardy-Weinberg平衡檢驗；觀察組和對照組SNP位點rs2228570和rs2282679基因型和等位基因分布差異無統計學意義(P＞0.05)；觀察組和對照組SNP位點1544410基因型和等位基因分布為10.31%比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4、表5和表6。

3 討論

兒童哮喘的發生可以導致心血管不良臨床結局的產生，從而加劇患者遠期生存的惡化，增加病死率及致殘率。近年來雖然在兒童哮喘的治療或者康復等方面取得了一定的效果，但其治療總體有效率或者病情緩解率等指標均無明顯改善[7]。本次探討了25羥基維生素D濃度及其受體基因多態性及其與哮喘患者病情的關系，具有下列幾個方面的現實意義：(1)能夠為哮喘的生物學治療提供理論基礎，為改善哮喘的急性期哮喘癥狀、改善肺通氣或者肺換氣等提供理論基礎；(2)能夠為哮喘治療后的臨床預后評估提供新的指標。

25羥基維生素D在結合糖蛋白配體后，可以促進細胞核內的三磷酸腺苷信號通路的激活，抑制細胞炎癥因子如IL-6或者腫瘤壞死因子的激活等，減輕炎癥因子對于支氣管平滑肌的浸潤，保護平滑肌細胞膜的完整性[8]；25羥基維生素D包含了多個可結合巰基的末端羧基結構，其與平滑肌細胞膜上鈣離子內流通道的結合，能夠降低鈣離子內流，促進血管內皮細胞分泌一氧化氮，促進平滑肌的擴張[9，10]。25羥基維生素D多態性的改變，能夠影響25羥基維生素D的生物學活性并抑制谷胱甘肽芳基轉移酶的活性，減輕氧化應激性損傷和線粒體或者氧化自由基對于平滑肌、黏膜組織的浸潤作用[11，12]。已經證實的是，25羥基維生素D濃度對于兒童哮喘的發生、治療結局、臨床預后等均具有一定的影響，但對于SNP位點rs2228570和rs2282679等基因型或者等位基因的研究不足。

本次研究通過相關指標的血清學水平的檢測分析發現，25-(OH)-VD在哮喘兒童中的表達濃度可顯著下降，從機制上考慮25-(OH)-VD的表達對于兒童哮喘的影響主要考慮與下列幾個方面有關[13，14]：(1)25-(OH)-VD的低表達會促進肺泡上皮細胞小氣道的狹窄，過度下降的25-(OH)-VD失去了其對于鈣離子通道的穩定作用，導致平滑肌的持續性處于氧化應激狀態；(2)25-(OH)-VD的低表達失去了其對于患者局部T淋巴細胞免疫功能的調控作用，導致病毒感染等誘導的平滑肌痙攣更為顯著。趙宏霞等[15]研究者在探討分析了73例哮喘兒童的血清學資料，發現25-(OH)-VD的表達濃度可平均下降25%以上，同時患兒的病情嚴重程度越高、治療后的病情緩解率越低，25-(OH)-VD的表達下降越為顯著。在不同的哮喘病情中可以發現哮喘的嚴重程度越高，25-(OH)-VD的表達下降越為明顯，提示了25-(OH)-VD與哮喘病情嚴重程度間的關系，這主要由于25-(OH)-VD對于哮喘病情進展過程中平滑肌細胞的收縮狀態的調控作用有關。但也有研究認為25-(OH)-VD的表達只與哮喘的發生有關，而與哮喘的病情無顯著性關系，存在相關結論差別的原因主要考慮與臨床病例的發病病程、基礎性治療措施等的差別有關。在探討25-(OH)-VD與肺功能的關系過程中發現可見，25-(OH)-VD與FEV1、FVC呈正相關，這主要由于25-(OH)-VD通過改善肺通氣或者肺換氣過程而影響到第一秒呼氣末期容積。最后，本文在探討25羥基維生素D的基因多態性的過程中發現，SNP位點1544410基因型和等位基因分布存在顯著的差別，其中GA或者A等位基因的比例明顯上升，提示GA或者A等位基因的差別可能是影響到25羥基維生素D多態性的主要位點。

表3 觀察組不同病情患兒25－(OH)－VD和肺功能比較

表4 觀察組和對照組rs2228570位點基因型和等位基因分布比較

表5 觀察組和對照組rs1544410位點基因型和等位基因分布比較

表6 觀察組和對照組rs2282679位點基因型和等位基因分布比較

綜上所述，哮喘患兒血清25-(OH)-VD水平降低，與肺功能呈正相關，其VDR基因rs1544410多態性與兒童哮喘存在一定的相關性。