全外顯子組測序在德朗熱綜合征診斷中的應用

楊黎明，張華，袁路，譚鑫，張富青

(鄭州市婦幼保健院，河南 鄭州45000)

德朗熱綜合征 (Cornelia de Lange syndrome，CdLS)是一種罕見的、多為散發的、常累及多個器官及組織的遺傳性疾病。其典型特征為特殊面容、生長遲滯(宮內及出生后)、多毛癥、上肢缺陷。IQ值介于30～102之間，很多患者有自閉及自我傷害的傾向。該疾病在人群中的發病率大概為1/10000，目前認為沒有種族和性別差異[1]。

1 材料與方法

1.1 材料 患兒，女，1天 G39+2周，因臀位剖宮產娩出，羊水III度污染，阿氏評分1分鐘8分，皮膚顏色，呼吸各扣1分。患兒系第1胎第1產，臍帶短、細，胎盤小，出生體重1800g，因足月兒小于胎齡急診轉入我院重癥監護室。體格檢查，（見圖1）：身長 39cm，頭圍 30.5cm，胸圍 30.5cm；足月小樣貌，發育異常，營養差，神志清，精神反應欠佳；顱面部畸形：弓形眉(一字眉)，濃眉，睫毛長，鼻梁扁平而寬，人中長；肢體畸形：四肢短小，梭形手，手指及腳趾指端短小，雙手指關節異常(只有2個指節)，四肢肌張力高；全身多毛，喂養困難(多次嘔吐)。B超提示動脈導管未閉，卵圓孔未閉。患兒父親23歲，母親22歲，均體健，家族中無遺傳病史，無血液病，精神病史，無傳染性家族史。母孕早期感冒一次，具體服藥情況不詳；血糖血壓正常，孕期圍產保健情況不詳。根據臨床資料，懷疑Cornelia de Lange綜合征。

1.2 方法 考慮到可能合并有其他的遺傳病，經與患者父親溝通同意后，取患兒外周血進行全外顯子組基因測序(WES)以及拷貝數變異(CNV)檢測。如果發現陽性突變，則采集患兒父母外周血進行Sanger測序技術驗證突變位點，以確定該突變是否為新發突變。CNV檢測主要用于檢測染色體非整倍體或100Kb以上已知的、明確的致病基因拷貝數變異。

圖1 患兒外觀

外顯子組是指基因組中全部外顯子區域的集合，它(人類基因組的蛋白編碼區域)代表不到2%的人類基因組，卻包含約85%的已知致病變異[2]。全外顯子組基因測序(WES)是指運用目標序列捕獲技術將全基因組中的全部外顯子序列捕獲并進行高通量測序，一次檢測人類基因組中約20,000個目標基因的分析方法。它只對基因組的編碼區域進行測序，這樣便將資源集中到最可能會影響表型的基因，因此能夠縮短周轉時間和節約成本。對單個和多個個體的全外顯子測序是尋找罕見病、復雜病或孟德爾病致病變異的常用方法。研究發現NGS技術所測得的變異中有多達2%難于重復，因此需要使用Sanger測序進行驗證[3]。Sanger測序法的優勢是其測序讀長能夠達到1,000bp，并且測序的準確率高達 99.999%[4]。

2 結果

德朗熱綜合征可分為[5]：I型：標準型，患者具有典型的顱面部特征，骨骼異常改變，宮內發育遲緩，中度到重度精神運動遲滯，若伴有嚴重畸形導致死亡。II型：溫和型，患者具有與類型I相似的面部特征，輕度至臨界精神運動遲滯，程度較輕的宮內和產后發育遲緩，沒有嚴重畸形或畸形程度不如I型 。III型：擬CdLS，患者具有類似CdLS的表型，主要由于染色體非整倍體改變或暴露于致畸環境中所致。

2.1 CNV結果 未檢出染色體非整倍體或100Kb以上已知的、明確的致病基因拷貝數變異(CNVs)。2.2全外顯子組檢測結果顯示 根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)指南(Richards et al,2015)，提示基因NIPBL的c.5567G＞T突變為一個致病突變位點。該突變發生在Armadillo-like helical功能結構域，在進化上保守，具有潛在的功能影響；經SIFT和Polyphen等對其進行蛋白功能預測，結果顯示為有害，且對該致病位點進行了Sanger測序驗證。因此，該患兒確診為德朗熱綜合征I型患者。該突變在其父母標本中均未發現，是一個新發突變。如下圖基因序列所示：BE0596為患兒，BE0596F為父親，BE0596M為母親；患兒NIPBL：NM_133433.3：exon29：c.5567G＞T：p.R18561，父母均正常。見圖2、圖3。

圖2 WES技術檢測結果

圖3 WES技術檢測基因序列分析

3 討論

德朗熱綜合征又名阿姆斯特丹侏儒癥，是一類多器官發育畸形的遺傳病。該病的臨床表現[1]：(1)宮內及產后生長發育遲緩(68%)；(2)肌張力高(100%)；(3)顱面部畸形睫毛長且卷曲(99%)、多毛癥(78%)、濃眉連眉(98%)、扁平鼻梁(85%)，人中長而扁平(94%)，上唇薄而下翻(94%)，鄂弓高(86%)；(4)骨骼異常上肢異常多于下肢異常，也可見四肢均短小(93%)，小手、小腳，指關節異常,第5指側彎(74%)；5)胃食管反流，喂養困難。 Kline 等[6]報道了CdLS患者的先天畸形包括：厚而粗的睫毛(99%)，連眉、弓形眉(98%)，長人中(94%)，小手和腳有細尖(90%)等。Mingyan Hei等[7]研究報道的20例中國德朗熱綜合征患者的臨床特征也證實了這些特征的發生頻率大致相同。Sielicka D等[8]研究也報道其特殊面容：弓形眉、連體眉、長人中、耳位低、上唇薄，顎/頜小。本例患者的臨床表現中存在生長發育遲緩、顱面部畸形、多毛癥、濃眉連眉指關節異常以及喂養困難與CdLS的癥狀相符，且基因檢測也進行了確診。

約65%的CdLS患者主要是由以下幾個基因突變導致[9]，NIPBL(5p13.2)占 50%～60%，SMC1(Xp11.2)及 SMC3(10q25)占 5%左右；此外，RAD21和HDAC8也是導致CdLS的常見致病基因。Krantz ID等[10]的研究也證實，60%病例為NIPBL基因突變，少部分為SMC1、SMC3基因突變。NIPBL基因突變的患者比非NIPBL基因突變患者表型更嚴重，患者生長發育遲緩、上肢畸形及語言發育遲緩都更加顯著[9-12]。該患兒屬于NIPBL的基因位點c.5567G＞T突變，且是一個致病突變位點。其遺傳方式分為2種：常染色體顯性遺傳(NIPBL、SMC3)，X連鎖顯性遺傳(SMC1)。超過99%的CdLS都是散發病例，是由新發突變導致的。該患兒父母檢測結果均正常，屬于新發突變。目前，國內報道的基因突變病例均為NIPBL基因發生突變[13]。如果父母為NIPBL導致的患者，則其后代均有50%的發病率；若父母為正常個體，則先證者的同胞患病率為0.5-1.5%。該患者基因檢測采用全外顯子組測序的方法進行。由于其對目標區域的覆蓋度更高，有利于基因變異的檢出，提高遺傳疾病的診斷率。2016年NATURE發表的一項前瞻性的全外顯子組測序的評估[14]，此篇文獻結果顯示，其診斷陽性率可高達57.5%，相對于傳統方法提高4成的診斷率；32.6%檢測陽性的患者，因此調整了治療方式，對他們的生活質量或者生命延長可有實質性的幫助。因此，專家認為全外檢測已可成熟應用在兒科,且建議針對疑似單基因疾病的患者，應把全外當成第一線檢測工具。2016年一篇發表在《European Journal of Human Genetics》上的文章顯示[15]，全外顯子組測序對未確診疾病的診斷率比經典遺傳診斷方法還高。鑒于本例的報道，以及疑似單基因遺傳病的患兒，全外顯子測序應是一項查找病因，提高確診率的良好手段。另外，如檢測結果發現，父母也有攜帶變異基因，可提示父母于再生育時做相關基因的檢測,避免患兒再發風險。