染料木素對大鼠骨髓間充質干細胞增殖能力的影響

康曉軍，李燕

(鞏義市人民醫院檢驗科，河南 鞏義451200)

大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一種具有多項分化潛能的間充質干細胞[1]，在再生醫學領域具有較大的應用前景[2-5]。研究表明，BMSCs可能有助于脊髓修復[6]，同時在治療多種罕見病中可能具有一定意義。例如，研究證實BMSCs能夠改善心肌缺血損傷后修復，這可能通過分泌調節因子產生效應[7,8]，通過某些化合物，比如透明質酸作用后，這種保護效應可能更明顯[9]。近年來越來越多的研究聚焦在中藥以及中藥中天然單體化合物在BMSCs中的調控效應上。淫羊藿素作用于BMSCs后，細胞增殖加快，這為細胞的擴增與大量獲取提供了新穎的途徑[10]，這可能與EGF產生相似的效應[11]。在定向分化方面，也有研究者證實中藥具有積極效應[12,13]。

染料木素是來源于大豆中的天然黃酮化合物，在先前的研究中，具有包括抗炎，抗氧化，抗腫瘤和調節血脂等生物學活性[14,15]。但是沒有研究報道其在干細胞增殖過程中具有調節作用。本實驗只在探索染料木素對大鼠骨髓間充質干細胞增值能力的影響并初步證實其作用機制，為染料木素進一步應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：SD大鼠2只，鼠齡3～4周，

購于重慶第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心(動物許可證號 SCXK(渝)2012-0005)。 主要試劑：FBS、DMEM低糖型培養基購于Hyclone公司。兔抗大鼠CD29-FITC(MA182001)、CD 45-FITC(MA182348)、CD 90-FITC(MA182247)抗體購于美國BD公司。成骨(RASMX-90021)、成脂(MKCMA-90031)誘導分化培養基試劑盒購于賽業(廣州)生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購于日本同仁公司(RK-067)。兔抗人 β-actin(QC-074)、Bcl-2(QC-134)和 Bax(QC-027)一抗和偶聯辣根過氧化物酶羊抗兔二抗(QC-1679)購于美國CST公司。染料木素(ST-215439)購于美國西格瑪公司。所有的引物由上海生工合成。凋亡檢測試劑盒(S0185)購自碧云天試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質干細胞的提取與培養 頸椎脫臼法處死大鼠后于無菌條件下分離四肢長骨并去除殘留組織。用注射器吸取DMEM低糖型培養基反復沖洗骨髓腔，隨后離心搜集細胞。重懸后接種于培養瓶中，置于37℃、5%的CO2以及飽和濕度的細胞培養箱內培養，每3d換液一次，當貼壁細胞融合度為80%～90%時傳代培養。使用第3代(P3)細胞進行試驗。

1.2.2 流式細胞術鑒定BMSCs表型 P3大鼠骨髓間充質干細胞融合度為90%時，消化重懸細胞，洗滌后分別加入 CD 29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗體各 2 μL，37℃避光孵育 30 min， 預冷的PBS洗滌2遍，用0.5 mL濃度為1%的多聚甲醛重懸固定30 min，流式細胞儀(美國，貝克曼，FC500)檢測熒光強度。

1.2.3 成骨成脂分化鑒定 P3大鼠骨髓間充質干細胞按照每孔2×105個細胞接種至6孔板中，培養融合度至60%～70%，加入成骨誘導分化完全培養基2ml。隨后按照試劑盒說明書進行誘導分化。成脂誘導分化時6孔板中要求細胞融合度為100%或者過融合，按照試劑盒說明書進行誘導和染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 通過CCK-8法檢測細胞增殖 P3大鼠骨髓間充質干細胞按照每孔2×103個細胞接種至96孔板中，適應培養過夜后，使用20μg/ml的染料木素處理細胞，連續培養7d，每天同一時間加入培養基10%體積的CCK-8試劑，孵育2h后在酶標儀450nm波長處檢測吸光度值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 P3大鼠骨髓間充質干細胞以每孔1×106個細胞密度接種于6孔板中，貼壁生長24h后，使用20 μg/ml的染料木素處理細胞48h，同時搜集上清中的細胞和貼壁細胞重懸后，按照AV/PI凋亡檢測試劑盒說明書孵育抗體，使用流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.2.6 實時熒光定量PCR P3大鼠骨髓間充質干細胞消化重懸后以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，適應生長過夜后，加入終濃度為20 μg/ml的染料木素處理細胞48h，以未加染料木素的細胞作為陰性對照，按照total RNA提取試劑盒說明書操作，提取細胞total RNA。吸光度法檢測RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，構建cDNA。加入相應試劑和熒光染料SYRB后，執行熒光定量PCR儀器進行檢測，實驗程序為：95℃預變性 15 s；95℃變性 5 s；65℃退火 30 s；40 個循環。最后結果以2-△△ct進行計算。實驗重復三次。引物序列如下所示：

1.2.7 蛋白印記法檢測相關蛋白表達水平 P3大鼠骨髓間充質干細胞消化重懸后以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，適應生長過夜后，加入終濃度為20 μg/ml的染料木素處理細胞48h，以未加染料木素的細胞作為陰性對照，加入相應體積的R細胞裂解液提取細胞總蛋白。通過BCA法檢測蛋白濃度并變形蛋白。配制SDS-PAGE凝膠后，對變性蛋白溶液進行凝膠分離，轉移進入PVDF膜上，使用5%的BSA常溫封閉2 h，切膜后分別加入已經稀釋完畢的兔抗人β-actin、Bcl-2和Bax一抗，4℃孵育過夜。TBST清洗后加入已經稀釋完畢的HRP偶聯羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。清洗后使用專用的ECL進行曝光。最終結果以β-actin作為內參，統計各組蛋白的相對表達量。

1.2.8 統計方法 所有的結果均以均數±標準差表示，使用SPSS 21.0進行統計分析。兩組間差異比較使用t檢驗進行統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的鑒定 提取原代細胞后，經過為期兩周的純化和培養，BMSCs逐漸成簇生長，見圖1A。通過成骨成脂誘導分化培養基的定向誘導后，提取的細胞具有多項分化的能力，見圖1B、1C。流式細胞儀鑒定提取細胞表型，CD45陰性表達，CD29和CD90陽性表達，見圖1D。上述結果表明提取的細胞為大鼠骨髓間充質干細胞。

圖1 大鼠骨髓間充質干細胞的鑒定

2.2 染料木素對BMSCs增殖能力的影響 細胞培養至P3后，以一定密度接種至96孔板中，使用不同濃度的染料木素處理細胞后，觀察BMSCs生長情況。結果表明染料木素顯著抑制BMSCs生長的其實濃度為20 μg/ml(P＜0.05)。在上述實驗基礎上，選取20 μg/ml的染料木素作為后續作用濃度，檢測其增殖曲線。結果表明染料木素顯著抑制BMSCs的生長，P＜0.05。 見圖 2。

圖2 染料木素抑制BMSCs的增殖，*P＜0.05，差異具有統計學意義。

2.3 染料木素對BMSCs凋亡的影響 細胞培養至P3后，以一定密度接種至6孔板中，使用染料木素處理細胞后，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果表明染料木素誘導細胞發生凋亡,P＜0.05。見圖3。2.4染料木素對BMSCs凋亡相關基因表達的影響細胞培養至P3后，以一定密度接種至6孔板中，使用染料木素處理細胞后，提取細胞總蛋白和總RNA并檢測凋亡相關基因的表達水平。結果表明，不論是在轉錄水平還是翻譯水平，染料木素都顯著上調BMSCs細胞Bax的表達水平，同時下調Bcl-2的表達水平，P＜0.05。 見圖4。

圖3 染料木素誘導BMSCs發生凋亡，*P＜0.05，差異具有統計學意義。

圖4 染料木素調節凋亡相關基因的表達，*P＜0.05，差異具有統計學意義。

3 結論

近年來，干細胞在多種疾病中的有益作用逐漸被發現[16]。隨著提取技術不斷完善[17,18]以及低免疫原等特性的發現，間充質干細胞在再生醫學中受到重視。骨髓間充質干細胞是一種來源于骨髓的間充質干細胞，增殖能力較強，免疫原性較低，在細胞移植過程中具有較好的耐受性。但是目前關于干細胞定向分化為特定類型細胞的研究進展并不順利，一方面，是分化效率較低，另一方面，是因為分化成熟度較差，分化完成的細胞移植后與機體并未在功能上形成一個有機的整體[19]。干細胞的增殖與分化處于動態平衡，因此抑制干細胞的增殖能力，可能有助于其分化[20]。染料木素已經報道能夠抑制多種細胞的增殖，因此本研究旨在探索其在大鼠骨髓間充質干細胞中的作用。

結果證實染料木素能夠抑制大鼠BMSCs的增殖。當使用染料木素處理細胞后，細胞倍增時間顯著升高。在機制研究中，通過流式細胞術證實染料木素能夠誘導細胞發生凋亡，該效應可能是通過上調Bax基因的表達同時下調Bcl-2的表達所致。Bcl-2和Bax是內源性線粒體凋亡途徑中的關鍵分子，二者處于動態平衡過程中[21,22]。當二者的比例發生變化后，內源性凋亡途徑被激活，細胞啟動凋亡過程[23,24]。我們的結果與先前的研究相符。

總之，本文證實染料木素能夠抑制大鼠骨髓間充質干細胞的增殖，該效應與其調節了內源性線粒體凋亡途徑Bcl-2和Bax蛋白的表達水平相關。這可能有助于大鼠骨髓間充質干細胞分化為特定類型的細胞，值得進一步研究。