MiR-149 rs22928323位點(diǎn)基因多態(tài)性與RA相關(guān)性分析

喻景奕，周公社

(周口市中心醫(yī)院骨科，河南 周口466000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀碜陨砻庖咝约膊1]。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為RA是一種自身免疫性疾病。研究顯示，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和促炎因子的分泌在RA的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[2]。micro RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，其生物學(xué)功能廣泛，包括凋亡、細(xì)胞分化、代謝、病毒防御等[3]。目前已有針對(duì) RA發(fā)生、發(fā)展中miRNA變化的研究，其中miRNA-149與RA關(guān)系密切。本研究探討微小RNA-149(MiR-149)rs22928323位點(diǎn)基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取確診的RA患者90例(RA組)、健康自愿者90例(健康組)，收集時(shí)間2014年1月-2016年12月。RA組，男14例、女76例，年齡42～78歲，平均55.9±11.6歲。健康組，男18例、女72例，年齡38～79歲，平均56.1±12.4歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

1.2納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)RA患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南[4]；(2)患者血清類風(fēng)濕關(guān)節(jié)因子(RF)陽(yáng)性；(3)手腕及關(guān)節(jié)X線片檢查確診；(4)對(duì)照組來(lái)源于門診體檢的健康自愿者；(5)獲得研究對(duì)象的知情同意及醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)伴有嚴(yán)重感染；(2)腫瘤疾?。?3)伴有免疫功能缺陷、低下；(4)近1個(gè)月使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制；(5)伴有嚴(yán)重的肝腎功能障礙。

1.3 基因檢測(cè)方法 抽取患者和健康自愿者外周靜脈血2ml，置于EDTA抗凝管中，采用 Trizol試劑盒(購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司)提取血清總 RNA，方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用PCR－RFLP分析技術(shù)測(cè)基因型，PCR引物引用文獻(xiàn)中成熟引物，由Invitrogen公司合成。限制性內(nèi)切酶Pvu II從NEBcutter查找并確定。 PCR 體系為 10μl，2×Mix 10μl，Primer F 1μl，Primer R 1μl，DNA 5μl，ddH2O 3μl，退火溫度58℃，PCR產(chǎn)物電泳瓊脂糖凝膠濃度2%，32個(gè)循環(huán)后得到長(zhǎng)度為254 bp的代表基因型為CC的PCR片段。產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 收集指標(biāo) 外周血白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、采用XT-2000全自動(dòng)全血分析儀檢測(cè)。尿蛋白、尿WBC采用羅氏Cobas C8000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。抗角蛋白抗體(AKA)采用和杰創(chuàng)新診斷試劑公司大鼠食管抗原片間接免疫熒光法檢測(cè)患者血清AKA。血清抗CCP抗體檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐洲診斷試劑公司，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析法；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的MiR-149 rs22928323位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果比較 RA組患者的MiR-149 rs22928323位點(diǎn)TC基因型50.00%高于健康組的28.89%(P＜0.05)，RA組的等位基因 T的頻率51.67%顯著的高于健康組的36.67%(P＜0.05)；見(jiàn)表1，圖 1。

表1 兩組患者的MiR-149 rs22928323位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

圖1 MiR-149 rs22928323位點(diǎn)的TC、CC、TT三種基因型電泳圖

2.2 兩組患者的一般資料檢測(cè)結(jié)果比較 RA組和健康組的年齡、性別、WBC、PLT、尿 WBC比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；RA組的尿蛋白、AKA陽(yáng)性率、CCP陽(yáng)性率均顯著的高于健康組(P＜0.05)；見(jiàn)表2。

2.3 多因素分析結(jié)果 Logistic回歸分析顯示：AKA陽(yáng)性表達(dá)、CCP陽(yáng)性表達(dá)、等位基因T的頻率增加是人群RA發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)；見(jiàn)表3。

3 討論

RA是一種慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎，終致關(guān)節(jié)的軟骨、韌帶、肌腱等各種組織以及多臟器損害[5]。RA的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，隨著對(duì)免疫學(xué)，分子生物學(xué)研究的不斷深入，RA的治療雖取得一定進(jìn)展，但至今仍處于控制或緩解癥狀階段，至今尚無(wú)特效治療。研究認(rèn)為，遺傳背景、環(huán)境差異、細(xì)胞凋亡、病毒感染等因素都與RA的發(fā)病密切相關(guān)[6]。MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[7]。miRNA可以與mRNA結(jié)合來(lái)抑制Mrnade轉(zhuǎn)錄，因此對(duì)基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期等生理過(guò)程起重要的調(diào)控作用。目前對(duì)miRNA的研究較為廣泛,miRNA作為抑癌基因或癌基因與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，低表達(dá)的miRNA與細(xì)胞分化缺失有關(guān)，在某些腫瘤中 miRNA出現(xiàn)高表達(dá)的情況。Chen Y[8]等研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)展譜系及分化程度和 miRNA表達(dá)譜一致。miRNA在免疫系統(tǒng)也中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)[9]，miRNA-520可以使造血干細(xì)胞的分化速度明顯加快。

表2 兩組患者的一般資料檢測(cè)結(jié)果比較

表3 RA發(fā)病的多因素分析結(jié)果

因此，miRNA被認(rèn)為是新的疾病標(biāo)記和潛在的疾病治療靶點(diǎn)，研究miRNA的單核苷酸多態(tài)性與疾病的相關(guān)性是很有價(jià)值的。目前已有針對(duì)RA發(fā)生、發(fā)展中miRNA變化的研究。已有文獻(xiàn)證明某些特定的 miRNA通過(guò)對(duì)免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如Zhou[10]等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146與RA的發(fā)病密切相關(guān)，可以控制在軟骨和滑膜的炎性反應(yīng)，從而減少骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)感覺(jué)過(guò)敏。Rodriguez[11]等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155可通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌來(lái)減緩關(guān)節(jié)的損壞。

抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體和抗角蛋白抗體(AKA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)對(duì)RA的診斷具有重要價(jià)值[12]。兩者聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)于篩查和輔助診斷早期RA有重要價(jià)值。PCR—RFLP分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的DNA標(biāo)記技術(shù)，原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。應(yīng)用PCR—RFLP，可檢測(cè)某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷。本研究中RA組的AKA陽(yáng)性率、CCP陽(yáng)性率均顯著的高于健康組(P＜0.05)；符合文獻(xiàn)報(bào)道[13]。 RNA-149 可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過(guò)程，RNA-149(MiR-149)rs22928323多態(tài)性位點(diǎn)位于前體，與肺癌、缺血性腦卒中等疾病的發(fā)生相關(guān)。有研究顯示，MiR-149的rs22928323多態(tài)性位點(diǎn)與RA的遺傳易感性相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，RA組患者的MiR-149 rs22928323位點(diǎn)TC基因型50.00%高于健康組的28.89%(P＜0.05)。RA組的等位基因T的頻率51.67%顯著的高于健康組的36.67%(P＜0.05)；OR=1.911，表明MiR-149 rs22928323單核苷酸多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。與肖茗淵[15]等的研究結(jié)果相一致，即等位基因T為風(fēng)險(xiǎn)等位基因。同時(shí)Logistic回歸分析顯示：AKA陽(yáng)性表達(dá)、CCP陽(yáng)性表達(dá)、等位基因T的頻率增加是人群RA發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)。進(jìn)一步證實(shí)了等位基因 T為風(fēng)險(xiǎn)等位基因。但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，目前的分析并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因的多態(tài)性與樣本臨床資料的相關(guān)性，因此有待進(jìn)一步研究。探討miRNA內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制在疾病發(fā)病中的作用，有助于尋找調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的靶點(diǎn)，以 miRNA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，進(jìn)行RA靶向治療。

綜上所述，miRNA-149通過(guò)對(duì)免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，其單核苷酸多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)。RNA-149(MiR-149)rs22928323位點(diǎn)等位基因T頻率增加是人群RA發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨著研究的不斷深入，以miRNA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，將會(huì)為RA的治療帶來(lái)新的希望。