高效液相色譜法同時測定靈芝糖漿中4種成分*

薛 平，黃強燕，李 莉，承 晨，張佳莉，王倬，姚 曉，顧崢嶸

（江蘇省常州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 常州 213000）

靈芝糖漿是由靈芝制成的單方制劑，功能養(yǎng)心安神、健脾和胃，用于心悸、失眠、食欲不振及神經(jīng)衰弱。其制備工藝主要是將靈芝粉碎成粗粉，照流浸膏劑與浸膏劑項下的滲漉法，用80%乙醇作溶劑，浸漬1周后，緩慢滲漉至無色，收集滲漉液，回收乙醇；藥渣加水煎煮2次，每次2 h，合并煎液，濾過，濾液與滲漉液合并，濃縮至相對密度為 1.16～1.18（60 ℃），加入蔗糖 600 g及苯甲酸鈉適量溶解后，濾過，加水調(diào)整總量至1 000 mL，攪勻，即得［1-3］。靈芝含有多糖類、氨基酸、多肽、三萜類、生物堿等多種化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)靜安神、降血糖、保肝解毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，其中三萜類和多糖類化學(xué)物質(zhì)被認(rèn)為是主要有效成分，常作為衡量靈芝質(zhì)量的依據(jù)［3-5］。目前靈芝糖漿質(zhì)量控制仍執(zhí)行《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十七冊）》，無指標(biāo)性成分控制。本研究中從三萜中的靈芝酸類成分角度出發(fā)，采用高效液相色譜（HPLC）法測定了市場上常見廠家不同批次的產(chǎn)品，為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司），包括 LPG-3400SDN泵，WPS-3000型TLSL Analytical自動進樣器，TTC-3000RS型柱溫箱，DAD-3000型二極管陣列檢測器；XP105DR型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

靈芝酸 C2（批號為 180517，含量為 98.19% ），靈芝酸 G（批號為 18032609，含量為 99.30%），靈芝酸 A（批號為18032603，含量為98.26%）均購于成都普菲德生物科技有限公司；靈芝酸B（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號為171030，含量為98.15%）。水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

靈芝糖漿分別來自5個不同廠家，即江蘇新先制藥有限公司、江西省芙蓉堂藥業(yè)股份有限公司、大理白族自治州中藥制藥有限公司、株洲千金藥業(yè)股份有限公司和江西杏林白馬藥業(yè)有限公司，編號分別為A，B，C，D，E。詳見表 1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［6-13］與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：安捷倫Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL ／min；流動相：乙腈 -0.05 moL 磷酸二氫銨水溶液（27 ∶73，V/V），等度洗脫；柱溫：15 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。取線性關(guān)系考察項下同一濃度的混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B、靈芝酸A峰的理論板數(shù)均不得低于3 500，分離度均大于1.5。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

分別取靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B、靈芝酸A對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每 1 mL含靈芝酸 C2100.1 μg、靈芝酸 G 100.3 μg、靈芝酸 B 100.4 μg、靈芝酸 A 100.2 μg的混合對照品貯備液。精密量取25 mL樣品溶液，用乙酸乙酯振搖提取5次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，乙酸乙酯提取液回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取空白試劑（水），按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取 2.2項下 3種溶液，進樣10 μL測定。陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液及供試品溶液色譜峰相應(yīng)處無4種被測組分的峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾，專屬性良好（圖1）。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品貯備液，精密吸取1，2，5 mL，分別置100 mL容量瓶；量取5 mL，置50 mL容量瓶，量取5 mL和8 mL分別置10 mL容量瓶。加入甲醇稀釋至刻度，制成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按擬訂色譜條件進行測定，進樣10 μL，以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 4種成分的線性回歸方程和線性范圍

精密度試驗：精密吸取線性關(guān)系考察項下同一濃度的混合對照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進測定6次。結(jié)果靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B和靈芝酸A的峰面積RSD分別為 0.48%，0.80%，0.78%和0.42%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：精密量取樣品（編號X-1）25 mL，依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B和靈芝酸A峰面積的RSD分別為 1.70%，1.35%，0.73%，1.29% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取樣品（編號X-1）25 mL，依法制備供試品溶液，分別在 0，4，8，12，16，24 h 時測定。結(jié)果靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝酸B和靈芝酸A峰面積的RSD分別為 1.59%，0.57%，0.73%，0.50% （n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密量取樣品15 mL（編號X-1），分別加入靈芝酸 C2（45.20 μg ／mL）1 mL，靈芝酸 G（102.7 μg ／mL）1 mL、靈芝酸 B（40.50 μg ／mL）0.5 mL和靈芝酸 A（81.10 μg／mL）1 mL，并稀釋至 25mL，依法制備供試品溶液，并測定含量，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

精密量取不同廠家各批次靈芝糖漿樣品，依法制備供試品溶液，并測定含量。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

前期試驗參考文獻［6］，使用流動相為乙腈-0.04%甲酸溶液梯度洗脫相同的色譜柱，經(jīng)過調(diào)整后未能使目標(biāo)峰達到較好地分離，曾考察流動相乙腈與0.05 moL／L磷酸二氫銨水溶液［9］或各種酸（0.1% 磷酸、0.1% 甲酸和 0.1% 冰醋酸）［6-13］、流動相流速（0.8 mL ／min 和1.0 mL ／min）、柱溫（15，25，35，40 ℃）［9-12］，發(fā)現(xiàn)流速為0.8 mL ／min、流動相為乙腈 -0.05 moL ／L 磷酸二氫銨水溶液（27 ∶73，V/V）、柱溫為 15 ℃時，目標(biāo)峰峰形較好，且分離效果較好，純度較高。檢測波長參考相關(guān)文獻并結(jié)合實際情況，發(fā)現(xiàn)在254 nm波長處目標(biāo)峰有較大吸收［6-13］，適宜作為含量測定的檢測波長。曾考察不同品牌色譜柱［250 mm × 4.6 mm，5 μm 的色譜柱（安捷倫Zorbax Eclipse PLus C18色譜柱、安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱、島津InertsiL ODS-3液相色譜柱和沃特世Waters X Bridge色譜柱）］均能使目標(biāo)峰達到較好的分離效果和純度。

3.2 提取條件優(yōu)化

前期試驗發(fā)現(xiàn)，4種靈芝酸含量相對較高，故選取為測定指標(biāo)性成分。由于樣品中4種靈芝酸含量普遍較低，且含有大量的蔗糖等水溶性物質(zhì)，所以測定前需要提取純化，并濃縮樣品。供試品溶液制備過程前期，考察了不同的提取溶劑［13-16］（石油醚 30 ～60 ℃ 、石油醚60～90℃、乙醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和甲酸乙酯）、提取過程加不加酸（甲酸）、最佳溶劑的提取次數(shù)（2，3，4，5，6 次）。根據(jù)試驗結(jié)果、提取效率和使用便利性，發(fā)現(xiàn)無需加酸，采用乙酸乙酯萃取5次，就可達到較滿意的提取效果。

表 4 24批樣品含量測定結(jié)果（μg／mL，n＝3）

3.3 結(jié)果分析

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同廠家的樣品含量具有顯著差異，生產(chǎn)廠家B（靈芝酸A）和生產(chǎn)廠家C（靈芝酸C2、靈芝酸A）2家的樣品部分靈芝酸已超出曲線范圍，推測可能由于原料和制劑工藝的差異性導(dǎo)致不同品牌之間含量差異顯著。測定了生產(chǎn)廠家A一批靈芝原料、樣品中間體，與廠家面對面交流后發(fā)現(xiàn)，在生產(chǎn)靈芝糖漿過程中，醇提滲漉液回收乙醇后，會出現(xiàn)大量的沉淀，為了后期樣品處理方便和得到最終完美清澈的溶液型樣品，棄去了大部分沉淀（脂溶性成分），對此部分沉淀的處理工藝控制不嚴(yán)，導(dǎo)致大量的靈芝酸類成分被棄去。這可能是同一品牌不同批次產(chǎn)品不穩(wěn)定，不同品牌靈芝糖漿靈芝酸類含量差異較大的主要原因。

目前，該制劑標(biāo)準(zhǔn)僅檢測了相對密度，缺乏專屬性檢查，導(dǎo)致市面上缺乏對該制劑品質(zhì)的衡量標(biāo)尺，4種靈芝酸含量相對較高，具有代表意義，方法相對簡便，結(jié)果可靠，可為廠家靈芝糖漿質(zhì)量控制與品質(zhì)評價提供參考。