基于表達譜芯片探索地五養肝膠囊防治肝癌的生物信息分析*

王明剛 陳 乞 高 翔 葉之華 肖明中 李瀚旻,△

1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院 (湖北 武漢, 430065) 2.湖北省中醫院 3.湖北省中醫藥研究院

原發性肝癌(PLC)是我國常見惡性腫瘤，肝細胞癌(HCC)是其主要類別，在全部惡性腫瘤中順位死亡率中已上升至第2位，占全球PLC死亡率的51%左右[1, 2]。在我國HBV感染相關HCC占絕大部分。考慮到龐大的HBsAg陽性感染率，肝癌人口標化率(中標率)呈逐步上升趨勢[3]。總體上看HCC具備發病隱匿、高發病率、高死亡率、高年增率的特性，是學術界公認的重大疑難疾病[4]。

如何切實有效地提高肝癌臨床治療效果是學術界面臨的巨大挑戰，中醫肝病專家李瀚旻教授提出 “髓失生肝”的肝癌病理機制，形成“補腎生髓成肝”防治肝癌的治療法則[5]。凝練為地五養肝膠囊(由熟地、五味子、姜黃、茵陳、甘草等組成)這一經典方藥，臨床研究證實地五養肝膠囊能顯著降低肝硬化發生率，改善肝再生微環境，降低肝癌發生率和肝癌發生風險[6]。機制研究發現該方能影響JAK/STAT、Ras/Raf/Mek/Erk信號通路相關蛋白表達，抑制骨髓干細胞轉化肝癌干細胞，促進肝細胞再生修復，改善肝再生微環境而抑制肝癌發生發展[5]。為深入探索地五養肝膠囊防治肝癌的分子機制，構建地五養肝膠囊防治肝癌的生物信息網絡，本研究將采用Solt-Farber二步法構建肝癌大鼠模型，地五養肝膠囊干預治療，收集肝癌組織，采用表達譜芯片檢測，提取mRNA差異表達信息進行生物信息學綜合分析，為深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 4～5周齡SD雄性大鼠，SPF級，體重(150±50)g，由湖北省疾病預防控制中心提供；二乙基亞硝胺(DEN)及二乙酰氨基芴(2-AAF) 購于sigma公司，地五養肝膠囊(批號：鄂藥制藥字Z20113160)由湖北省中醫院肝病研究所提供。

1.2 造模方法 雄性SPF級SD大鼠，48只，4-5周齡，體重(150±50)g。大鼠按隨機數字法分為空白對照組(Normal)、模型組(Model)、地五養肝治療組(DWYG)每組16只。造模第1天，模型組與地五養肝治療組按50mg/kg的劑量一次性腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)作為啟動劑，2周后均按15mg/kg/d劑量予以二乙酰氨基芴(2-AAF)灌胃7天，第3周末行2/3肝部分切除術(PHx)，切除肝左葉和中葉。地五養肝治療組于造模期間按750mg/kg/d劑量給予地五養肝膠囊水溶液灌胃、空白對照組則給予等量生理鹽水灌胃對照。

1.3 標本收集與芯片檢測 成模后地五養肝膠囊中藥干預16周，16周后即時處死各組大鼠，取腫瘤組織，Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，全部芯片檢測樣本均質量控制合格，使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit對樣本進行標記，使用Agilent SureHyb進行雜交實驗。使用Agilent GeneSpring GX v12.1進行芯片標準化操作，挑選差異表達的mRNAs。topGO軟件對差異mRNAs進行GO分析與PATHWAY分析。

2 結果

2.1 地五養肝膠囊可影響大鼠肝癌組織多個mRNA表達 以Fold Change>2，P<0.05為條件進行差異mRNA篩選，與模型組比較地五養肝膠囊下調481個大鼠mRNA表達，上調236個mRNA表達，差異表達聚類熱圖如下。

2.2 地五養肝膠囊調控的差異mRNA GO分析

2.2.1 地五養肝膠囊下調的mRNA GO分析 對地五養肝膠囊下調的481個mRNA進行GO分析，在生物學過程中可影響細胞損傷反應(化學應激)、細胞組織發育過程，循環系統(微血管育)發育等過程；在細胞組份中可影響細胞外基質、細胞外囊泡、細胞外膜結合、膜結合囊泡；生物學功能可影響蛋白質結合、鈣離子結合、細胞粘附分子結合、生長因子結合、蛋白質同二聚體活性等功能。見表1。

2.2.2 地五養肝膠囊上調的mRNA GO分析 對地五養肝膠囊上調的236個mRNA表達進行GO分析，在生物學過程中可影響細胞間粘附、細胞內受體信號通路、類固醇激素反應、有機環狀化合物反應等過程，在細胞組份中可影響離子通道復合體、跨膜轉運復合體、突觸膜、質膜區等細胞組份。在分子功能中可影響金屬離子結合、序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合、類固醇激素受體等分子生物功能。見表2。

2.3 地五養肝膠囊調控的差異mRNA PATHWAY分析

2.3.1 地五養肝膠囊下調的mRNA PATHWAY分析 地五養肝膠囊下調的481個mRNA進行PATHWAY分析，發現其可影響緊密連接信號途徑、造血細胞功能途徑、膽汁分泌信號通路、肌動蛋骨架調節通路、ECM受體相互作用通路、細胞因子-受體相互作用通路等。見圖1。

圖1 地五養肝膠囊下調的mRNA PATHWAY分析

2.3.2 地五養肝膠囊上調的mRNA PATHWAY分析 地五養肝膠囊下調的236個mRNA進行PATHWAY分析，發現其可影響癌癥轉錄失調信號通路、GnRH信號通路、糖酵解/糖異生信號通路、PPAR信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、TRP通道炎癥介質調控信號通路等。見圖2。

圖1 地五養肝膠囊上調的mRNA PATHWAY分析

3 討論

長期以來，肝癌的防治策略多集中在腫瘤細胞本身，外科手術切除、放療、化療均以有效清除或殺死腫瘤細胞為目標，隨著對肝癌防治水平未見實質性提高的反思及對發病機制復雜性的深入認識，近年來在對肝癌發病機制及防治策略上逐步由著眼肝癌細胞本身向肝癌微環境方向轉變，已形成新的肝癌防治策略[7]。肝癌微環境指非肝癌細胞和細胞外基質所共同構成的復雜混合物，從類別上區分，HCC微環境主要包括了纖維化微環境、血管微環境、免疫微環境、氧化微環境和干細胞微環境等。 這些微環境之間存在相互關聯、相互影響的復雜關系[8]，但難以形成關鍵概念來統籌這些微環境的根本落腳點。肝病專家李翰旻教授提出肝癌異常肝再生微環境的基本概念[7,9]，認為HCC的發生與發展其本質是異常肝再生微環境的形成與維持過程，各種肝癌微環境可與肝再生異常微環境產生直接或間接的復雜影響關系，并提出基于“補腎生髓成肝”的中醫藥改善肝再生微環境防治HCC的治療新策略，充分發揮中醫藥防治肝癌的多次層、多時限、整體、動態調控的療效優勢[10]。

表1 地五養肝膠囊下調的mRNA GO分析

地五養肝膠囊正是在“補腎生髓成肝”防治肝癌理論指導下形成的有效中藥制劑，方中熟地滋陰補腎，五味子柔肝補腎，兩藥相合增強補腎之功；茵陳清熱利濕而退黃，姜黃活血化瘀而通絡，生甘草清熱解毒。甘草與五味子清熱養陰、酸甘化陰，全方共奏補腎養肝、利濕退黃、活血通絡之效。前期研究已經證實該方具有防治肝癌發生與發展的臨床治療效果，本研究構建了大鼠肝癌模型，地五養肝膠囊進行干預處理，發現該方可上調肝癌組織236個mRNA表達，下調481個mRNA表達，體現出該方存在的多層次、多靶點、多途徑發揮療效機制的可能。在對地五養肝膠囊下調的481個mRNA進行GO分析中發現，該方可影響細胞損傷反應(化學應激)、循環系統(微血管)發育過程；影響細胞外基質、細胞外囊泡、細胞外膜結合等細胞組份；影響蛋白質結合、鈣離子結合、細胞粘附分子結合、生長因子結合等功能。在對地五養肝膠囊上調的236個mRNA表達進行GO分析，在生物學過程中可影響細胞間粘附、細胞內受體信號通路、類固醇激素反應、有機環狀化合物反應等過程，在細胞組份中可影響離子通道復合體、跨膜轉運復合體、突觸膜、質膜區等細胞組份。在分子功能中可影響金屬離子結合、序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合、類固醇激素受體等分子生物功能。綜合分析，地五養肝膠囊可調控細胞損傷反應、循環系統(微血管)發育過程這可能與阻斷肝臟腫瘤惡性增生及微血管新生存在關聯，并且可影響腫瘤組織細胞外基質和細胞外囊泡傳遞等細胞組份及細胞間交流方式。

地五養肝膠囊下調的481個mRNA進行PATHWAY分析，發現其可影響緊密連接信號途徑、造血細胞功能途徑、膽汁分泌信號通路、肌動蛋白骨架調節通路、ECM受體相互作用通路、細胞因子-受體相互作用通路等相關。地五養肝膠囊下調的236個mRNA進行PATHWAY分析，發現其可影響癌癥轉錄失調信號通路、GnRH信號通路、糖酵解/糖異生信號通路、PPAR信號通路、神經活性配體-受體相互作用信號通路、TRP通道炎癥介質調控信號通路等。這些信號通路均與肝癌的發生與發展、侵襲與轉移關系密切，深入探索地五養肝膠囊通過影響以上信號途徑發揮的療效機制有重要現實意義。