從TLRs介導的炎癥信號通路研究補腎方的抗肝損傷機制*

趙彬彬 汪 蓉 姜煜資 張 瑩 高月求 陳建杰 王靈臺 聶紅明△

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院(上海，200021) 2.上海市浦東新區中醫醫院

大多數慢性肝病是一種嚴重的進展性疾病，肝損傷伴隨慢性肝病進展的全部過程。因此，有效的治療肝損傷對于延緩慢性肝病的進展具有重要的意義。肝損傷是多種肝臟疾病共有的病變結果，乙醇、藥物、毒物、病毒等許多因素都可以誘導肝損傷。肝損傷的發生機制復雜，例如氧化應激、CYP450 酶系代謝異常、內毒素、免疫反應、炎癥因子以及各種信號通路等。其中Toll 樣受體(TLRs) 作為一個模式識別受體家族，其介導的炎癥信號通路廣泛參與和加劇了各種肝損傷的發生發展[1～8]。

補腎方是由王靈臺教授所創，歷經30多年的臨床驗證及其課題組相關研究，表明補腎方具有顯著抗肝損傷作用，但其作用機制尚待明確。前期研究中已經發現，補腎方具有下調多種炎癥介質作用，如TNF、IL-6、IL-1等，同時,我們還發現,補腎方能下調TLR3/9的表達,補腎方的抗肝損傷作用可能與其抑制TLRs相關炎癥信號通路,從而下調炎癥介質相關[9～11]。因此，本文試從TLRs介導的炎癥信號通路來進一步闡明補腎方的抗肝損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級健康成年C57BL小鼠42只，雌雄各半，體質量18～22g，購自上海西普爾必凱實驗動物中心，實驗小鼠均飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物房，清潔飲水，自由取食。

1.1.2 實驗藥物及主要試劑 采用以補腎方及其拆方為組方的我院院內制劑—補腎沖劑(滬衛藥N(97)-080，均采用深圳華潤三九現代中藥有限公司生產的中藥免煎顆粒。)補腎方：由仙靈脾、菟絲子、甜蓯蓉、桑寄生、生地、枸杞子、虎杖、黃芩、苦參各15g、青皮10g；補腎方拆方：補腎陽組(仙靈脾、菟絲子、甜蓯蓉各15g)、補腎陰組(桑寄生、生地、枸杞子各15g)、清化濕熱組(虎杖、黃芩、苦參各15g)；引經藥：青皮9g。

刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma-Aldrich。肝功能試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 ELISA試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司。蛋白質印跡分析使用的一抗：抗TLR4，抗TLR3和抗TLR9購自NovusBiologicals LLC；抗TNF-相關聯因子(TRAF)6，抗IFN調節因子(IRF)3，抗TBK1，抗TRAF相互作用蛋白(TIRP)購自Abcam；反核因素(NF)-κB，抗MyD88購自Cell Signaling Technology。二抗購自R&DSystems。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物處理 雌雄不限，隨機分成7組。A組(正常，Control)：等體積生理鹽水(NS)；B組(模型組，Con A)：等體積NS；C組(補腎全方組，BSQ)：等劑量補腎方；D組(補腎陽組，BSY)：等劑量補腎陽藥物；E組(補腎陰組，BSC)：等劑量補腎陰藥物；F組(清化濕熱組，QH)：等劑量清化濕熱藥物；G組(引經組，YJ)：等劑量引經藥物。各組均予以灌胃給藥，A、B組給予同體積的生理鹽水，C～G組給予同劑量相應藥物，每天給藥1次，連續給藥7天，第7天給藥后4h，除正常組外均給予ConA15mg/kg尾靜脈注射，注射后18h處死老鼠。

1.2.2 指標檢測 肝功能指標：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)和膽堿酯酶(ChE)；肝組織HE染色；ELISA法檢測外周血相關炎癥介質如(IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-β)；Western Blot法檢測TLR3/4/9相關信號通路鏈中的關鍵蛋白，如(TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-κB、TIRP、MyD88)。

2 結果

2.1 補腎方對實驗小鼠肝功能的影響 見圖1。

圖1 各組實驗小鼠肝功能指標的變化(*P<0.05)

2.2 各組實驗小鼠肝組織病理變化情況 肝組織HE染色表明，補腎全方及拆方各組均具有一定的改善肝組織炎癥壞死的作用，但補腎全組、補腎陽組中壞死區域的面積與模型組相比顯著減小。見插頁圖2。

2.3 各組初小鼠外周血炎癥因子水平 見圖3。

圖3 各組實驗小鼠主要炎癥因子IL-6、TNF-α、TNF-β、IL-1的表達情況

2.4 各組實驗小鼠TLR3/4/9信號通路關鍵蛋白的表達情況 Western Blot檢測結果表明，ConA處理后TLR3/4/9相關信號通路鏈中的關鍵蛋白如TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-κB、TIRP、MyD88的表達均增加，補腎全方及其拆方處理后，TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、NF-κB、MyD88在補腎全組中表達減少，TLR9、TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88在補腎陽組中表達減少，TLR9、TLR3、TRAF6、NF-κB在補腎陰組中表達減少，TRAF6在清化濕熱組中表達減少。

3 討論

Toll樣受體(TLR)是參與天然免疫的一類重要蛋白質分子，通過特異識別病原微生物及其細胞壁上的一些保守成分，啟動非特異性免疫，并誘導特異性免疫，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁。所有TLR由氨基末端結構域組成，其特征在于多個富含亮氨酸的重復序列和羧基末端TIR與含TIR的適配器交互的域。Toll樣受體(TLRs)構成一系列受體，直接識別廣譜的外源性和內源性配體，在實現先天性和適應性免疫應答中發揮關鍵作用，并參與細胞增殖，存活，凋亡，血管生成，組織重塑和修復[12]。在先天免疫髓樣細胞中，TLRs誘導炎癥分泌因子[13]。

TLR主要激活信號傳導介質MyD88(下游所有TLR成員除了TLR3)和TRIF(含有TIR域的銜接子誘導干擾素-β)最終導致激活NF-κB通路和幾種促炎癥分泌細胞因子[14]。MyD88 通路活化包括三條途徑：通過 NF-κB-促炎性細胞因子通路，激活炎性細胞因子 IL-6、TNF-α 基因致其表達；通過 IRF3/5-IFNα/β或IRF7/5-IFNα/β 通路激活 I 型干擾素基因致其表達；通過MAPK激活CD80、CD86 共剌激因子表達，參與獲得性免疫反應。MyD88 通路中的NF-κB促炎通路參與炎癥慢性化和癌癥發生發展；MyD88 通路中的非 NF-κB 促炎通路和非MyD88 通路(TRIF-IRF3/5/7-IFNα/β)，通過介導干擾素產生，并啟動特異性免疫。已知TLR和MyD88是NF-κB的上游調節因子，在各種類型的細胞中，MyD88介導的信號傳導激活轉錄因子NF-κB和AP-1等，最終導致免疫調節劑(如細胞因子)和抗菌劑(包括AMP)的轉錄[15]。過盲腸結扎和穿刺(CLP)提高了TLR4，TLR2和(MyD88)蛋白表達水平，曲古菌素A(TSA)可以減弱TLR4，TLR2和(MyD88)蛋白表達水平，其研究結果表明TSA通過抑制膿毒癥期間TLR介導的炎癥反應來減輕肝損傷[16]。Jung-Woo Kang等研究結果表明，褪黑激素通過調節TLR介導的炎癥反應，改善I / R誘導的細胞凋亡從而保護肝臟[17]。先前已有研究表明CD14是TLR依賴性促炎細胞因子產生所必需的，Chen Z等繼續研究發現在敗血癥條件下上調CD14表達時，TLR的MyD88依賴性和TRIF非依賴性途徑被激活，該研究破譯了TLR與CD14之間的關鍵性交叉對話[18]。

本課題組從國家六五攻關項目開始確立補腎法為主治療慢性乙型肝炎的研究，歷經 30 余年臨床驗證，證實補腎法和補腎方治療慢性乙型肝炎的有效性。同時對補腎法的免疫調控機制進行了系統的研究，在機制探討中，課題組在各級別課題資助下開展了系列實驗研究，證實補腎方通過對免疫的多環節調控作用發揮其抗炎和促生干擾素效應。其效應包括：增強 IL-2、IFN等 Th1 型細胞因子的表達，抑制 IL-4、IL-10 等 Th2 型細胞因子的表達，促進 CD8+的CTL功能活化等；提高 NKT 細胞數量，改善外周血樹突細胞共刺激分子表達，促進IFN分泌等。并且發現，補腎方能促進慢性乙型肝炎患者外周血 PBMC中Toll樣受體(TLR)3和9表達而介導抗炎效應[9～11]。

本研究進一步證實，補腎方及其各主要配伍組分均有一定的抗肝損傷作用，補腎小鼠方效果，優于各主要配伍組分。值得一提的是，補腎陽組小鼠AST顯著下降(P<0.05)，補腎陰組小鼠ALT顯著下降(P<0.05))，而補腎全方組小鼠ALT、AST均顯著下降(P<0.05)，也一定程度說明中醫配伍的重要性。通過對炎癥因子的分析，補腎全方組的IL-6、IL-1、TNF-α、TNF-β均顯著下降(P<0.05)，補腎陽組的TNF-β、IL-1顯著下降(P<0.05)，而補腎陰組的TNF-α、TNF-β、IL-6顯著下降(P<0.05)，再次說明補腎陽與補腎陰在補腎方中的配伍協同性。ConA處理后TLR3/4/9信號通路中關鍵蛋白TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-kB、TIRP、MyD88的蛋白表達均顯著增加，說明TLR通路被刀豆蛋白A介導的免疫炎癥反應激活。TLRs通路激活后，信號轉導途徑通過細胞外信號調節激酶，如c-JunN-末端激酶、p38、絲裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3-激酶，轉錄因子IRF3/5/7，NF-κB，激活蛋白-1以及一些重要的銜接蛋白(如MyD88，TRIF，TRAM、TRAF6等)協調炎癥反應[19，20]，最終促進相關炎癥介質的表達。補腎方干預后的結果表明,補腎方通過抑制TLR3/4/9的表達及其下游通路中關鍵蛋白的表達，影響TLRs介導的炎癥信號通路, 最終下調相關炎癥介質，發揮其抗肝損傷作用。 同時發現，不同配伍組分對TLR3/4/9及其下游通路中關鍵蛋白的影響不盡相同，通過全方配伍后能協同增效，這也是中醫組方配伍的魅力所在。

需要指出的是，由于TLRs在肝臟多種免疫細胞的表面均有表達，如T淋巴細胞、肝枯否氏細胞等，若需要進一步明確補腎方對TLRs及其相關信號通路的抑制是作用在哪種細胞，則需要找到更適合的動物模型，該模型既能造成免疫性肝損傷，又能在炎癥區域成功分離提取和培養出相關免疫細胞。