VEGF/PTEN及下游信號通路在侵襲性垂體瘤中的表達及其臨床意義

毛建輝，孫昭勝，郭 洪，魏建輝，司 娜，邱 雷，郭連峰，鄭 磊

垂體瘤是常見單克隆起源的腺瘤，約占顱內腫瘤的10%，多為良性，但仍有部分具有侵襲性，表現出惡性腫瘤生長特征的核分裂現象，并易侵犯鄰近腦組織，被稱之為侵襲性垂體腺瘤[1，2]。手術是侵襲性垂體瘤的首選治療方式，目前臨床廣泛應用經鼻蝶竇顯微鏡和內鏡手術，但由于垂體瘤所侵襲的結構復雜，單一手術完全切除比例困難且復發率高，治療效果不佳[2]。因此，侵襲性垂體瘤的治療多主張手術、藥物及放射性治療聯合應用，以實現患者個體化治療目標[3，4]。近年來，藥物治療在侵襲性垂體瘤治療中廣泛開展，其中靶向藥物因治療特異性強、不良反應少、藥效顯著等優點，在治療中具有廣闊的前景[4]。本研究通過探討VEGF、PTEN及其下游P-Akt、p-MAPK信號通路在侵襲性垂體瘤的表達變化，以期為侵襲性垂體瘤藥物治療靶點的選擇提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院神經外科2007-08至2017-04行手術治療的62例垂體瘤患者(男29例，女33例)手術標本，均于術后貯存于液氮中。所有患者術前均未接受放療、化療或激素治療，術前均行頭顱MRI檢查，并行蝶鞍區薄層平掃，并根據Hardywilson和Knosp分級和分期標準進行診斷。入選標準：(1)術前影像數據顯示為Knosp分Ⅳ級；術前影像數據顯示為Knosp分級Ⅲ/Ⅳ級；(2)術中可見腫瘤侵入海面竇內、鞍底或斜坡骨質破壞、術后病理結果證實為腫瘤細胞浸潤硬膜。另選取60例正常垂體組織(對照組)，標本來源于交通意外及其他死亡后尸體捐獻者，所有患者家屬均簽署知情同意書。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR檢測VEGF和PTEN表達水平 提取組織標本中的總RNA，后對其進行反轉錄。以GAPDH作為內參，通過使用SYBR Green Premix Ex Taq-based assay試劑盒(Takara Bio Inc., Japan)進行實時定量PCR擴增。

VEGF的上游引物序列為5′-CTA CCT CCA CCA TGC CAA GT-3′,下游序列為5′-AGC TGC GCT GAT AGA CAT CC -3′；PTEN的上游引物序列為5′-AGC ATC ACC ATT CTT TGC TG-3′,下游序列為5′-ACC ACA GCC ATC GTT ATG AA-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′,下游序列為5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3′。每個反應均包含15 ng相應的cDNA，PCR擴增條件為：95 ℃預熱1 min，95 ℃變性1 min，55 ℃(GAPDH)，58 ℃(VEGF)，60 ℃(PTEN)退火和延伸30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環。所有檢測樣本重復3次，計算-ΔΔCt ，以平均相對含量2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔΔCt (目的基因)-ΔΔCt(內參基因)計算標本中VEGF和PTEN的相對含量。

1.2.2 Western blot檢測 采用蛋白提取試劑盒提取組織標本中的總蛋白進行Western blot實驗，分別檢測樣本中磷酸化Akt、MAPK和總Akt、MAPK表達水平，相應檢測抗體購自Cell signal transduction，二抗分別為HRP標記的鼠抗兔、兔抗鼠IgG抗體，用ECL化學發光試劑曝光顯示蛋白條帶，利用軟件分析條帶灰度值。

2 結 果

2.1 一般資料分析 根據入選標準，62例分為侵襲性垂體瘤32例(侵襲組)，其中男22例，女10例；非侵襲性垂體瘤30例(非侵襲組)，其中男18例，女12例。兩組患者一般資料差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05，表1)。

表1 垂體瘤患者及對照組一般資料比較 (n;%)

2.2 VEGF和PTEN基因在垂體瘤中表達水平比較 實時定量PCR檢測結果表明，垂體瘤標本中VEGF的表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(t=9.40,P<0.05)，且在侵襲組的表達高于非侵襲組，差異有統計學意義(t=10.60,P<0.05，表2)；PTEN在侵襲性垂體瘤中的表達顯著低于對照組，差異有統計學意義(t=6.31,P<0.05，表2)。

基因名稱侵襲組(n=32)非侵襲組(n=30)對照組(n=60)VEGF3.61±0.16①②2.06±0.13①0.96±0.11PTEN0.42±0.10①0.86±0.11①1.01±0.09

注:與對照組比較，①P<0.05；與非侵襲組比較，②P<0.05

2.3 p-Akt和p-MAPK在垂體瘤中表達變化比較 圖1可見Western blot檢測結果，侵襲組標本中，p-Akt和p-MAPK水平明顯增強。垂體瘤標本中p-Akt、p-MAPK水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(t=12.95,t=7.29,P<0.05)，且侵襲組的p-MAPK表達高于非侵襲組，差異有統計學意義(t=10.60,P<0.05，表3)；與對照組和非侵襲組相比，侵襲組p-Akt的表達水平略有增高，但差異無統計學意義(P>0.05，表3)。

基因名稱侵襲組(n=32)非侵襲組(n=30)對照組(n=60)p-Akt3.90±0.14①2.27±0.11①0.98±0.08p-MAPK2.52±0.11①②1.89±0.05①0.97±0.06

注:與對照組比較，①P<0.05；與非侵襲組比較，②P<0.05

圖1 垂體瘤患者及正常人Western blot檢測比較各組p-Akt、p-MAPK變化情況

3 討 論

侵襲性垂體瘤是垂體腺瘤的一種特殊類型，可向鞍底、硬膜、海綿竇等周圍腦組織結構侵犯，具有術后易復發的特點[1]。目前，侵襲性垂體瘤的治療首選手術治療，以期最大程度解除腫瘤的占位效應，同時還可一定程度控制激素水平[1-3]。因此，確定手術入路和切除程度，需要依賴腫瘤的生長方式、形狀及對周圍結構的浸潤進行綜合判斷[4]。文獻[3]研究發現，采用經蝶入路手術的全切率可提高為60%，且手術存在如腦脊液漏、顱神經麻痹、尿崩及術中血管損傷等并發癥，存在一定局限性。近年來，針對侵襲性垂體瘤直接手術較困難的問題，藥物治療亦可作為首選治療或術前治療。此外，隨著垂體瘤發病機制、及基因治療等研究的深入，藥物靶點的選擇作為侵襲性垂體瘤的治療方向正逐漸受到重視[4]。

研究證實，PTEN作為重要的腫瘤抑制基因，其可參與包括腫瘤細胞的侵襲、增殖、凋亡，及通過多種信號通路影響血管生成[5]。PTEN基因編碼的雙特異性蛋白磷酸酶，可通過去磷酸化磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)將其轉化為磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)，提示PTEN可發揮蛋白激酶信號級聯負調節作用[6]。作為腫瘤的生物標記物，PTEN失調已經在多種腫瘤中被檢出[7]。本研究發現，PTEN基因在正常垂體組織中的表達水平顯著高于垂體瘤組織，且侵襲性垂體瘤中的表達水平顯著低于非侵襲組。此外已有研究表明，AKT是調節細胞功能的中樞調節因子，其參與腫瘤的發生和轉移[8]。PTEN是抑制PI3K/AKT信號通路磷酸化的主要調節子，其功能缺失可引發PIP3在細胞內的積聚，從而過度激活下游Akt信號通路，導致細胞生長過度、凋亡減少、以及血管生成[8]。本研究結果發現，垂體瘤患者中PTEN的表達水平顯著降低，且p-Akt水平明顯增高，而侵襲組表現更為顯著。此外，本研究也發現，侵襲組患者中，總AKT的表達水平較非侵襲組和對照組略有增高，但差異無統計學意義。這些結果表明，PTEN基因的失調及PI3K/AKT的過度表達或磷酸化可能參與垂體瘤細胞的增殖和侵襲。

VEGF在促進腫瘤血管生成過程、以及腫瘤細胞的發生、發展、浸潤過程中發揮重要作用，阻斷VEGF被認為是最為有效的抗腫瘤治療方法之一[9]。在正常的血管發展和腫瘤細胞形成中，PTEN功能缺失都可促進VEGF介導的血管生成，提示PTEN和VEGF在血管生成機制中存在相關性。本研究發現，垂體瘤患者中，PTEN的表達水平顯著低于對照組，而VEGF的表達水平則顯著高于對照組，且侵襲組PTEN在的表達低于非侵襲組，而VEGF的表達則顯著增高，與文獻[10]報道基本一致，提示PTEN和VEGF在垂體瘤生長和侵襲中發揮作用。然而，腫瘤細胞生長和侵襲所依賴的新生血管的生長和成熟需要復雜多因子和多信號傳達過程[9, 11-13]。已經證實，VEGF可通過MAPK、PI3K/Akt等途徑誘發細胞內信號轉導，從而激活細胞增殖作用[20]。本研究結果發現，垂體瘤組織中MAPK和AKT信號通路激活程度顯著高于對照組，表現在p-MAPK和p-Akt水平顯著增高，且侵襲組激活程度更高。結果表明，PTEN/VEGF及其下游信號通路在垂體瘤生長、侵襲過程中發揮重要作用。

綜上所述，本研究發現侵襲性垂體瘤中VEGF、p-Akt及p-MAPK水平明顯增高，而PTEN表達水平顯著降低，提示上述變化可能與垂體瘤的侵襲性相關，其可能為診斷并治療侵襲性垂體瘤靶點的選擇提供新方向。但本研究為單中心臨床研究模式，標本量較少，下一步將擴大樣本量，并收集多中心數據進行比較。另外，PTEN/VEGF信號通路與其他信號通路如FLT1、MMP2在垂體瘤發生發展的相互關系亦需深入研究，以期為治療侵襲性垂體瘤靶點基因的選擇提供新思路。